發(fā)布時間：2020-09-09 13:55

　　 研究背景 隨著肝細(xì)胞分離、高密度培養(yǎng)以及生物反應(yīng)器等技術(shù)的日臻成熟，新一代以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的現(xiàn)代生物人工肝(bioartificial liver，BAL)——體外人工肝支持系統(tǒng)(extracorporeal bioartificial liver support system，EBLSS)被認(rèn)為是治療因各種原因所致暴發(fā)性肝衰竭或急性肝衰竭(fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF，acute hepatic failure，AHF)最有前途的，并已在動物實驗及臨床應(yīng)用中取得了確切療效。肝細(xì)胞作為BAL的主要生物成分，在該系統(tǒng)中扮演著舉足輕重的角色。正常人肝組織和培養(yǎng)人肝細(xì)胞是理想的BAL細(xì)胞源和體外藥物代謝模型，但由于全世界范圍內(nèi)的供肝短缺以及原代培養(yǎng)時存活時間短和難以傳代等缺點，使得利用正常人肝臟分離肝細(xì)胞來作為BAL的細(xì)胞源顯得非常困難。胎肝細(xì)胞尤其是從較大月齡胎肝分離到的肝細(xì)胞，雖能在體外繼續(xù)分化增殖，且免疫原性弱，較少引起異種蛋白反應(yīng)，但同樣受制于來源問題和倫理學(xué)原因，使得難以在臨床推廣應(yīng)用。 為此有學(xué)者試度采用永生化肝細(xì)胞來克服這些不足，如C3A、HepG2、CL—1等細(xì)胞系。在美國采用C3A和HepG2細(xì)胞構(gòu)建EBLSS治療FHF動物和少量臨床試驗已獲肯定結(jié)果，其中以C3A細(xì)胞構(gòu)建的EBLSS已被批準(zhǔn)進(jìn)行二期臨床試驗。但上述細(xì)胞系均來源于腫瘤細(xì)胞，研究顯示無論在P450活性、氨清除功能以及尿素合成等方面均不如豬肝細(xì)胞，加之以腫瘤源性肝細(xì)胞作為治療工具，用于處于免疫抑制狀態(tài)下的FHF患者，尤其是將接受肝臟移植、需終生使用免疫抑制劑的患者身上，總覺令人擔(dān)憂。本實驗采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將猿猴病毒40大T抗原(SV40LTag)基因轉(zhuǎn)染至來源于正常成人原位肝移植的供肝細(xì)胞，建立一永生化肝細(xì)胞系。 m03浙江人學(xué)博士論文 第一部分摘嬰 新型人源性肝細(xì)胞系的構(gòu)廷 材料和方法 SV40 DNA（strain 776）、月 質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、IV型膠原酶、 hepatoZYME－SFM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、G418等購自美國Invitrogen 公司； 真核表達(dá)載體 pCDNA3．1（－）為本研究所保存載體；胎牛血清＊BS）購自美國 Hyclone公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒。凝膠電泳切膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試 劑盒等購自美國 QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶 BamH、限制性內(nèi)切酶 BstX l、T4連接酶、DNA Marker等購自美國 Promega公司；DHS u大腸桿菌山本 實驗室提供。實驗所需主要試儀器設(shè)備有：PCR擴增儀、蛋白核酸測定儀、純 水儀、低溫高速離心機、水平電泳儀、低溫冰箱，凝膠電泳成相系統(tǒng)、自行設(shè)計 的體外灌流裝置。成人肝細(xì)胞來自一位O型血、年齡25歲的健康男性原位肝移 植供肝。 首選采用 PCR方法，以 SV40全序列 DNA為模板，擴增 SV40LTag DNA； T4 DNA連接酶連接經(jīng) BamH酶切 SV40LT8g DNA牙 pcDNA3．1（十 構(gòu)建 SV40LTag—pCDNA3．1卜）重組載體并轉(zhuǎn)化至 DHS Q大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過 BStX酶切鑒定和 DNA序列測定以確定重組載體；最后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 SVp0LTag—pCDNA3．1（－）重組載體轉(zhuǎn)染至正常成人肝細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，直 至獲得陽性克隆細(xì)胞并觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)特征。 結(jié)果 經(jīng)DNA序列測定和比只結(jié)合GenBank網(wǎng)站公布的SV40LTag DNA序列， SV40LT8g基因共 2607hp正確插入真核表達(dá)載體 pCDNA3．1（－卜利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染法將 SV40LTag—pcDNA3．1（－）重組載體轉(zhuǎn)染至正常成人肝細(xì)胞，經(jīng) 700S G418篩選 42天，出現(xiàn)一明顯的上皮細(xì)胞樣抗 G418的陽性克隆 細(xì)胞，空載體組和空白對照組細(xì)胞大多死亡。形態(tài)學(xué)觀察表明，轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞呈上 皮細(xì)胞樣、單層貼壁生長，在含 15％FBS的低糖 DMEM培養(yǎng)基中，傳代一次只 需3＊天時間：相比在怕p扒。＊＊MB8「M無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖時間明顯延 2 2皿3iM江大學(xué)博士論文 柬一部分摘嬰 新型人源性肝細(xì)胞床的構(gòu)延 長，傳代一次需5天時間：但轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中不予傳代存活時間相 差無幾，約12天左右，之后便出現(xiàn)迅速死亡。 結(jié)論 1 在國內(nèi)首次利用正常成人肝移植供肝進(jìn)行肝細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)。 2在國內(nèi)首次利用 SV40LTag 基因和真核表達(dá)載體 pCDNA3．1個卜 構(gòu)建 SV40LTSP—PCDNA3．1（－）重組載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至成人肝細(xì)胞建立一永生化 肝細(xì)胞。 3新建人源性肝細(xì)胞系在體外可無限傳代。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R575.3
【部分圖文】：

SV40限制性內(nèi)切酶位點圖

甘加.心毖.。翻側(cè)毖側(cè)門.洲目.，日翻扭口11，..’，側(cè)，I二萬困月.側(cè).1側(cè)日加.沖“日.如硯h.胭面.已妙.甲...吻自.圖1SV40限制性內(nèi)切酶位點圖

圖3真核表達(dá)載體PeDNA3.1‘)人肝細(xì)胞人原位肝移植的供肝細(xì)胞來自一位O型血、年齡25歲的合法健方法用實驗試劑的配制常用平衡鹽溶液等的配方(g/L)(參考Pollardetal.1997，鄂征1HankSD一HankSW膠原酶胰蛋EOTA液O3IZ·6HZO4·7HZO液液液液.n乙n04no_400.400，404040400.060.060.060.060.060.10一0.10一0.100.10

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2815059