【摘要】： 研究背景 肝纖維化是各種原因引起的慢性肝損傷結(jié)果,是肝硬化形成的病理基礎(chǔ)。探討肝纖維化的發(fā)生機(jī)制及防治方法具有重要的社會價值和經(jīng)濟(jì)意義。盡管現(xiàn)已認(rèn)為肝纖維化在一定情況下可被逆轉(zhuǎn),但目前尚未有公認(rèn)有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化藥物,因此肝纖維化治療一直是慢性肝病研究的重點和難點。 本課題組前期研究及近年來國內(nèi)外研究表明,肝內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)與肝纖維化形成密切相關(guān)。慢性肝損傷導(dǎo)致肝內(nèi)RAS的各組分上調(diào),進(jìn)一步可導(dǎo)致氧應(yīng)激、炎癥細(xì)胞聚集和肝纖維化形成。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是這個系統(tǒng)的主要效應(yīng)成員,它能刺激肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)增殖與活化,并能釋放炎癥因子、生長因子以及促纖維化因子等,誘導(dǎo)HSC合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)及抑制ECM降解,導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過度沉積,促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展。近年來越來越多的證據(jù)表明,應(yīng)用RAS的阻斷劑可以減輕肝損傷、抑制肝纖維化形成和降低門靜脈高壓。 近年來,ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸的發(fā)現(xiàn),引起了許多研究者的濃厚興趣。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (angiotensin converting enzyme, ACE2)降解AngⅡ并同時產(chǎn)生Ang-(1-7). Ang-(1-7)在體內(nèi)外能拮抗AngⅡ的活性,具有舒張血管、降低血壓、利尿、抑制成纖維細(xì)胞增殖等作用。此外,Ang-(1-7)還可以競爭性地與AngⅡ的受體AT1R結(jié)合,因此被認(rèn)為是一種內(nèi)源性AngⅡ阻斷劑。由于ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸具有與經(jīng)典RAS (ACE-AngⅡ-AT1R軸)相反的作用,因而被假設(shè)為具有抗纖維化作用,有可能成為肝纖維化治療的新策略。 然而ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝纖維化中的研究少有報道。目前的研究報告發(fā)現(xiàn),慢性肝損傷反應(yīng)促發(fā)ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝內(nèi)表達(dá)增強(qiáng),而阻斷這條軸的作用則會導(dǎo)致肝損害加重。然而,ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸影響肝纖維化的諸多環(huán)節(jié)尚未得到充分闡述,具體機(jī)制尚不清楚。肝纖維化的特點是ECM的合成分泌增加和降解減少,導(dǎo)致ECM大量沉積致纖維結(jié)締組織增生。膠原是ECM的主要成分。HSC是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞,HSC活化、增殖、轉(zhuǎn)型和分泌膠原在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。近來對纖維化信號機(jī)制的研究表明,Smad和Rho/ROCK信號通路是新發(fā)現(xiàn)與RAS作用相關(guān)的兩個重要途徑,與膠原合成密切相關(guān)。因此,本研究將觀察ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝纖維化動物模型和培養(yǎng)細(xì)胞株HSC中的表達(dá),探討ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸對HSC膠原合成及Smad和Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響,這對于闡明ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝纖維化中的作用及其機(jī)制有重要意義。 方法 1、利用四氯化碳(CCl4)造成肝中毒損傷,構(gòu)建肝纖維化大鼠模型,通過HE染色法觀察肝臟組織病理的改變,免疫組化方法觀察ACE2在肝組織中的表達(dá)及分布,RT-PCR法檢測ACE2和Mas受體mRNA的表達(dá)水平,Western blot法檢測ACE2蛋白表達(dá)水平；以HSC為體外實驗刺激對象,通過RT-PCR法和Western blot法,檢測不同濃度AngⅡ干預(yù)時ACE2和Mas受體的表達(dá)水平。 2、應(yīng)用AngⅡ與Ang-(1-7)干預(yù)HSC,及利用信號通路抑制劑阻斷方法,通過Western blot法檢測Smad3磷酸化表達(dá)水平,免疫熒光法觀察Smad4核轉(zhuǎn)位,應(yīng)用地高辛標(biāo)記的凝膠阻滯實驗檢測Smad-DNA結(jié)合活性；通過Western blot法檢測RhoA蛋白表達(dá)水平,RT-PCR法檢測ROCK2 mRNA水平。 3、應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),構(gòu)建含針對ACE2基因的RNA干擾序列的慢病毒敲除載體,并感染HSC細(xì)胞株,real time PCR法和Western blot法檢測干擾效率；通過Western blot、RT-PCR、基因定量(QuantiGene)等方法,檢測AngⅡ和Ang-(1-7)干預(yù)及ACE2基因沉默前后HSC中COL1和CTGF表達(dá)的變化,同時利用信號通路抑制劑阻斷方法,比較分析ACE2-Ang-(1-7)對HSC膠原合成的影響。 結(jié)果 1肝纖維化大鼠肝內(nèi)ACE2和Mas表達(dá)增高 在給予大鼠皮下注射CCl44周后,HE染色見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝纖維結(jié)節(jié)形成；免疫組化表明,肝臟ACE2表達(dá)水平明顯增加,而且廣泛分布；RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,CCl4注射2周后大鼠肝內(nèi)ACE2 mRNA水平輕度增加,但CCl4累積到4周時,ACE2水平顯著增加(0.509±0.105 vs 0.114±0.044,P=0.000)。Western blot結(jié)果顯示,ACE2蛋白表達(dá)水平變化與ACE2 mRNA表達(dá)水平相一致。Mas基因表達(dá)水平與ACE2的表達(dá)變化基本平行。此外,應(yīng)用perindopril(一種ACE抑制劑(ACE inhibitor, ACEI))可促使肝損傷大鼠ACE2水平上調(diào),提前出現(xiàn)ACE2增高,且增高水平較單獨CCl4處理組顯著(P=0.000)。 2 AngⅡ處理后HSC中ACE2和Mas表達(dá)增高 AngⅡ干預(yù)處理HSC 24hr后,ACE2及Mas mRNA的表達(dá)水平增加,且與不同濃度干預(yù)的AngⅡ呈劑量依賴性效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)AngⅡ升至1μmol/L (μM)時兩者表達(dá)與對照組比較均有顯著性意義差別(分別為對照的1.553±0.090和1.536±0.053倍,均P0.01)。Western blot分析進(jìn)一步證實不同濃度AngⅡ處理后,HSC中ACE2蛋白水平呈劑量依賴性地增高。此外ACEI預(yù)處理組可使ACE2表達(dá)及Mas mRNA水平較AngⅡ處理組進(jìn)一步增加(均P0.01)。 3 Ang-(1-7)抑制AngⅡ激活HSC中Smad信號通路 在AngⅡ干預(yù)HSC 5min后,即可檢測到磷酸化Smad3 (pSmad3)增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(為對照的2.183±0.222倍,P=0.003),15 min時pSmad3蛋白水平達(dá)到高峰,之后pSmad3逐漸降低。AngⅡ干預(yù)0-120min內(nèi)各時間點非磷酸化Smad3蛋白表達(dá)水平無明顯變化。AngⅡ處理HSC 20 min后,免疫熒光檢測可見Smad4蛋白明顯的核轉(zhuǎn)位；凝膠阻滯實驗(EMSA)顯示Smad DNA-結(jié)合活性較對照組顯著增加(為對照的9.007±1.007倍,P=0.000)。單獨Ang-(1-7)干預(yù)HSC與對照組相比無顯著變化(均P0.05)。Irbesartan (AT1R阻斷劑)或Ang-(1-7)預(yù)處理HSC可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Smad3磷酸化(均P0.01)、Smad4核轉(zhuǎn)位以及Smad DNA-結(jié)合活性增加(均P0.05),Mas受體阻斷劑A779則明顯逆轉(zhuǎn)Ang-(1-7)對AngⅡ誘導(dǎo)Smad3磷酸化和Smad DNA結(jié)合活性增加(均P0.01),提示AngⅡ通過AT1R途徑迅速激活Smad通路,Ang-(1-7)則通過Mas受體發(fā)揮拮抗AngⅡ作用。SB203580 (p38 MAPK的抑制劑)預(yù)處理亦可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)Smad3磷酸化(P=0.000),而PD98059 (p42/44 MAPK或稱ERK 1/2的抑制劑)預(yù)處理組則否(P=0.575)。提示AngⅡ快速激活Smad通路依賴于p38 MAPK的活化。 4 Ang-(1-7)抑制AngⅡ激活HSC中Rho/ROCK通路 AngⅡ干預(yù)處理HSC 24hr后,RhoA蛋白表達(dá)及ROCK2 mRNA水平較正常對照顯著增高(均P=0.000), Irbesartan、Ang-(1-7)以及Y27632 (ROCK抑制劑)預(yù)處理組RhoA蛋白與ROCK2 mRNA表達(dá)均顯著低于AngⅡ處理組(均P0.01)。A779可以逆轉(zhuǎn)Ang-(1-7)抑制AngⅡ誘導(dǎo)RhoA與ROCK2表達(dá)的作用(均P0.01)。實驗提示AngⅡ通過AT1R途徑激活Rho/ROCK通路,Ang-(1-7)則通過Mas受體拮抗此作用。 5 ACE2-Ang-(1-7)抑制AngⅡ誘導(dǎo)HSC膠原合成 設(shè)計shRNA并構(gòu)建慢病毒載體,驗證HSC感染細(xì)胞株中針對ACE2基因的干擾效率,Western blot檢測基因敲除后ACE2蛋白水平約為正常對照的2/3(0.154±0.018 vs 0.446±0.026,P=0.000),命名為Lenti-SiACE2。 分別利用RT-PCR檢測Ⅰ型膠原(COL1) mRNA、Western blot檢測結(jié)締組織生長因子(CTGF)蛋白以及QuantiGene Plex方法分析COL1和CTGF mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果提示AngⅡ作用24hr后,可誘導(dǎo)HSC中COL1和CTGF表達(dá)增加,與正常對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。Lenti-SiACE2感染細(xì)胞后COL1和CTGF表達(dá)與正常HSC對照無差別(P=1.000),但加入AngⅡ刺激后,它們的表達(dá)顯著增強(qiáng),較AngⅡ干預(yù)正常HSC細(xì)胞株更加明顯(均P0.01),提示ACE2基因干擾后AngⅡ促HSC膠原合成作用放大。Ang-(1-7)預(yù)處理可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC COL1和CTGF高表達(dá)(均P=0.000),此作用可被其Mas受體的阻斷劑A779逆轉(zhuǎn)(均P=0.000). QuantiGene Plex檢測數(shù)據(jù)還提示,Ang-(1-7)對AngⅡ誘導(dǎo)COL1和CTGF mRNA表達(dá)的抑制程度較SB203580、PD98059以及Y27632對AngⅡ的這種抑制更加明顯(與Y27632組CTGF表達(dá)比較P0.05,其余均P0.01)。提示HSC膠原合成有多種信號通路參與調(diào)節(jié),Ang-(1-7)可通過全面阻斷AngⅡ的活性而抑制HSC膠原合成。 結(jié)論 1、隨著肝纖維化進(jìn)展大鼠肝內(nèi)ACE2和Mas受體表達(dá)增強(qiáng),可能是機(jī)體對肝損傷應(yīng)激的一種自我保護(hù)機(jī)制。在體外HSC中ACE2和Mas受體表達(dá)隨AngⅡ濃度增加而增高,推測這是HSC中RAS維持系統(tǒng)平衡的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,即對過多AngⅡ的拮抗反應(yīng)。此結(jié)果支持ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸對肝纖維化起保護(hù)作用的假設(shè)。ACEI上調(diào)ACE2的表達(dá),可能有延緩肝纖維化進(jìn)展的作用。 2、AngⅡ可通過其受體ATlR激活HSC中Smad和Rho/ROCK信號通路,這可能是AngⅡ促肝纖維化的重要機(jī)制。Ang-(1-7)可通過拮抗AngⅡ的活性而抑制AngⅡ?qū)@兩個通路的激活。另外,p38 MAPK的抑制劑可以減少AngⅡ誘導(dǎo)的Smad3磷酸化,提示AngⅡ可以經(jīng)非TGF-β依賴途徑直接激活Smad信號通路。 3、AngⅡ刺激可顯著增加HSC中COL1和CTGF的表達(dá),ACE2基因沉默后加重AngⅡ?qū)@兩者的誘導(dǎo)表達(dá)作用,而Ang-(1-7)則可抑制AngⅡ?qū)λ鼈兊恼T導(dǎo)表達(dá),且其抑制程度較p38 MAPK, ERK 1/2和Rho/ROCK的阻斷劑對AngⅡ誘導(dǎo)COL1和CTGF表達(dá)的抑制作用更加明顯。結(jié)果提示ACE2-Ang-(1-7)可通過拮抗AngⅡ的作用而明顯抑制HSC中膠原的合成,起著重要的抗纖維化作用,這對于擴(kuò)展肝纖維化治療新策略具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2
【圖文】：

livertissuefromratsafter4weeksofCC從 +PerindoPriltreatmeni.Originalmagnifieation200X.1小3肝內(nèi)ACEZ和 MasmRNA表達(dá)水平的檢測RT一PCR結(jié)果(圖1一3)顯示，在對照組大鼠肝臟中，只有低水平的ACEZlllRNA表達(dá)。與對照組相比，CCI;處理2周后大鼠肝內(nèi)ACEZ水平輕度增加，但CCI;累積注射到4周時， ACEZmRNA水平較對照顯著增加 (0.509士 0.105vs0.114士0.044，p=0.000)。與單獨CC14處理組相比，同步給予ACEI保護(hù)組肝臟ACEZmRNA表達(dá)水平在2周時已有明顯增高 (0.654士 0.065vs0.233士住073，尸=0.000)

預(yù)HSC后不同時間點smad3的磷酸化水平，得到能夠反映Angn誘導(dǎo)Smad3磷酸化表達(dá)的理想實驗處理時間，以便于下一步實驗研究。 Westemblot檢測磷酸化Smad3(PSmad3)顯示(圖2一l)，正常對照HSC細(xì)胞Smad3磷酸化水平很低，在Angn干預(yù)smin后，psmad3即有明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(為對照組的2.153士0.222倍，尸=0.003)，在干預(yù) Hselsmin時，psmad3蛋白水平達(dá)到高峰(5.102士0.264)

AngZ120mln圖2一1.Angn誘導(dǎo)smad3磷酸化的時間效應(yīng).Fig.2一 1.T油 eeourseof曲 osPhorylationofSma由 indueedbyAng11inHSC.HSCwereineubated側(cè) th10七mo比劫 911加 m5to120minutes(laneZ一lane6).(^)Phosphorylat‘，d- Smad3ProteinexPressionanalyZedbyWestemblot.(B)Densitometrieanalysisofwestemblot.*尸‘ :0.01versuscontrol.#尸 <0.05versuseontrol.Resultsare小 emean士 50of恤 eseParateexpenments

【引證文獻(xiàn)】

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1 武淑君;霍麗娟;張婕;王晉江;賈慧;;大鼠肝纖維化過程中ACE 2、Ang(1-7)的動態(tài)變化[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2013年19期

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本文編號：2804319