【摘要】：背景與目的 炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)是一組病因不明的慢性、易復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's Disease, CD),本病在我國近20年的發(fā)病率呈上升趨勢。 乳酸桿菌在促進(jìn)腸道菌群平衡,調(diào)節(jié)腸粘膜免疫功能和增強(qiáng)腸粘膜屏障、防御病原方面起著重要作用。白細(xì)胞介素-10(IL-10)又名細(xì)胞因子合成抑制因子,是典型的抗炎與免疫抑制性細(xì)胞因子,在炎癥性腸病的發(fā)展中起著重要的作用,同時在誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)和CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的長期生存、抑制機(jī)制的維持中發(fā)揮比較重要的作用。 本實驗將IL-10基因?qū)肴樗釛U菌并表達(dá),并將其用于硫酸葡聚糖鈉(dextran sodium sulphate, DSS)造模小鼠的治療,觀察其對小鼠腸道炎癥的影響,對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 方法 第一部分構(gòu)建表達(dá)白介素10(IL-10)的重組乳酸桿菌 人工合成信號肽系列與IL-10基因連接后克隆到干酪乳酸桿菌(lactobacillu casei, L. casei)整合型表達(dá)載體pIlac的lac啟動子下游,得到重組質(zhì)粒pIlac-sp-IL10,電穿孔轉(zhuǎn)化L. casei CECT 5276。挑選轉(zhuǎn)化后的耐藥菌落在含紅霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng),抽提染色體DNA, PCR及測序鑒定證實IL-10基因是否整合到干酪乳酸桿菌的基因組中,Western blot檢測重組蛋白表達(dá)。第二部分轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌聯(lián)合5-氨基水楊酸對實驗性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的影響及機(jī)制的初步探討 將實驗小鼠分為七組,正常對照組,DSS造模組,DSS造模+5-ASA治療組,DSS造模+乳酸桿菌組(菌液2×108CFU/ml)+5-ASA治療組；DSS造模+低劑量轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌組(菌液2×107CFU/ml)+5-ASA治療組；DSS造模+中劑量轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌組(菌液2×108CFU/ml)+5-ASA治療組；DSS造模+高劑量轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌組(菌液2×109 CFU/ml)+5-ASA治療組。于試驗第十一天將小鼠處死,觀察指標(biāo)包括小鼠一般情況,結(jié)腸長度,結(jié)腸組織病理學(xué)評分(histopathological score, HS),疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)等,并分別對小鼠外周血行pCR檢測NF-κB、PPAR-γ、IFN-γ、TGF-β、IL-10,結(jié)腸粘膜組織行western blotting檢測PPAR-γ/IFN-γ、TGF-β、IL-10水平。 結(jié)果 第一部分 成功將IL-10基因整合到干酪乳酸桿菌的基因組中；轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌產(chǎn)生的目的蛋白部分分泌進(jìn)入培養(yǎng)上清。 第二部分 1濃度2×108CFU/ml的轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌對實驗性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的改善優(yōu)于2×108CFU/ml的乳酸桿菌(P0.05)； 2三種濃度(2*107CFU/ml,2*108CFU/ml,2*109CFU/ml)的轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌對實驗性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥改善效果不一：濃度越高,效果越明顯。 結(jié)論 轉(zhuǎn)IL-10乳酸桿菌對實驗性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥緩解有一定效果,效果和濃度有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R574.62
【圖文】：

復(fù)旦大學(xué)攻讀碩士學(xué)位研究生畢業(yè)論文而后使其自然冷卻);(lD將膠從染色液中取出，放入新的平皿中，用水輕輕沖洗數(shù)次，倒入在搖床上平穩(wěn)搖動6、sh，其間更換洗脫液3次(或者每次用微波爐加脫色會更快且不需搖床);(l3)待完全脫色后，用清水沖洗數(shù)次，用凝膠系統(tǒng)照相。WesternBloting實驗流程:·膠的處理:小心將膠放入100mL陰極buffer，平衡15min·膜的處理:用尺子量作膠的大小，剪同樣大小的一片PVDF膜，用%)浸泡155，再用雙蒸水浸泡Zmin，取出用陽極b。fferl工平衡IOm·半干法轉(zhuǎn)膜:按下面順序放膠、膜和濾紙，插上電源，1.ZfnA/c耐轉(zhuǎn)

一4工L一10與信號肚拼接的PCR電泳圖經(jīng)純化后與p工Lac空載體同時進(jìn)行酶切，桿菌，獲得陽性克隆后電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌定，鑒定電泳圖如下1234M15001DDO900800700600500400e00

分子量與工L一10蛋白相符，而原始菌的電泳則無相應(yīng)的蛋白條帶(圖1一6)，說明工L一10在干酪乳酸桿菌中得到了分泌表達(dá)。3.兒一10在L.casei中的表達(dá)的穩(wěn)定性將工程菌在無選擇壓力條件下培養(yǎng)50代并凍存，菌液抽DNA做PCR仍可檢測到工L一10基因，接種的菌液在乳糖誘導(dǎo)后仍可分泌工L一10，培養(yǎng)物進(jìn)行dot一blot仍可檢測到工L一10表達(dá)。第29頁

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 熊亞明;潘善培;陳敬;黃丹;關(guān)藝青;;構(gòu)建表達(dá)豬卵透明帶抗原(pZP3α)的重組乳酸桿菌[J];暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2009年02期

2 王紅梅,李大金,姜紅,袁正宏;hCGβ在乳酸桿菌中的分泌性表達(dá)[J];生殖與避孕;2003年03期

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本文編號：2803364