【摘要】： 潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis, UC)是一種病因不明的腸道慢性炎癥性疾病,近年來(lái)在我國(guó)近年呈高發(fā)趨勢(shì),高復(fù)發(fā)率是其突出特征。然而,由于基本機(jī)制不明,目前UC治療的根本目標(biāo)仍然是控制癥狀,誘導(dǎo)緩解。如何更有效的防治UC復(fù)發(fā)是臨床亟待解決的問(wèn)題。 近年UC發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展,給治療學(xué)提供了新的啟示。目前關(guān)于UC發(fā)病機(jī)制的基本共識(shí)是:易感個(gè)體在環(huán)境因素作用下,腸黏膜屏障削弱,腸道致病菌群及其有害成分穿過(guò)黏膜屏障,和有缺陷的免疫系統(tǒng)相接觸,引發(fā)局部炎癥反應(yīng),細(xì)菌不能被及時(shí)清除,使病情遷延反復(fù)。人體腸道處于復(fù)雜的帶菌環(huán)境,腸黏膜表面積約有300m2,腸道內(nèi)大約有500種共生菌,每克結(jié)腸內(nèi)容物含有多達(dá)1012株共生菌,而易感個(gè)體腸黏膜屏障通透性顯著升高,使細(xì)菌通過(guò)腸黏膜屏障的機(jī)會(huì)增加,由此可見(jiàn),對(duì)于已經(jīng)有遺傳缺陷的個(gè)體,及時(shí)清除黏附于腸壁表面和偶然突破腸黏膜屏障的致病菌是防止疾病發(fā)生和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。 抗菌肽在維持腸道黏膜屏障不被細(xì)菌入侵中起決定作用。它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的殺菌劑,對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)均具有殺菌作用。防御素是人體腸道最主要的抗菌肽,結(jié)腸細(xì)胞主要表達(dá)防御素-1(humanβ-defensin 1, HBD-1)和防御素-2(humanβ-defensin 2, HBD-2)。 研究表明,維生素D在調(diào)控防御素表達(dá)中起關(guān)鍵作用,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)UC患者普遍存在維生素D缺乏,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)維生素D受體基因敲除的小鼠更容易誘導(dǎo)出結(jié)腸炎,且結(jié)腸炎癥狀因補(bǔ)充活性維生素D獲得緩解。只有活化的維生素D才具有生物學(xué)效能,然而活性維生素D即1,25-(OH)2D3循環(huán)濃度僅為0.03~0.06ng/ml,而其發(fā)揮抗菌作用所需生物作用濃度高達(dá)循環(huán)濃度數(shù)十甚至上百倍,提示維生素D可能存在一種局部活化形式。2001年Zehnder D證實(shí)結(jié)腸上皮細(xì)胞存在維生素活化的關(guān)鍵限速酶—25-羥維生素D 1-α-羥化酶(25-Hydroxyvitamin D3 1-alpha-hydroxylase, CYP27B1),因而我們推測(cè)CYP27B1可能是維生素D對(duì)防御素局部調(diào)控的關(guān)鍵。為此我們進(jìn)行了如下研究:①收集UC患者和正常人腸黏膜組織標(biāo)本,檢測(cè)CYP27B1、防御素-2(HBD-2)在腸黏膜中的表達(dá)及其相關(guān)性;②采用過(guò)表達(dá)策略,構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-CYP27B1并感染Caco-2細(xì)胞,觀(guān)察高表達(dá)CYP27B1對(duì)Caco-2細(xì)胞HBD-2和HBD-2表達(dá)的影響;③對(duì)比觀(guān)察維生素D聯(lián)合5-氨基水楊酸(5-ASA)與單獨(dú)應(yīng)用5-ASA對(duì)緩解期UC病人累積緩解率的影響,評(píng)價(jià)活性維生素D作為緩解期維持治療藥物的效能。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下三部分: 第一部分CYP27B1在潰瘍性結(jié)腸炎腸上皮組織中的表達(dá)及其與防御素-1、防御素-2的關(guān)系 目的:檢測(cè)人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜中CYP27B1和HBD-1、HBD-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá),探討CYP27B1與防御素表達(dá)之間的關(guān)系,以及其在UC發(fā)病中的作用。 方法:①依據(jù)臨床資料、血液生化指標(biāo)及內(nèi)鏡表現(xiàn),選擇在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科診斷明確的活動(dòng)期UC患者。②免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)UC和正常對(duì)照結(jié)腸組織中的表達(dá)。③real-time Q-PCR方法測(cè)定UC患者和正常對(duì)照結(jié)腸上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。④Western blot檢測(cè)UC患者和正常對(duì)照結(jié)腸上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)con組:正常結(jié)腸黏膜;(2)uninfl組:UC患者非炎癥結(jié)腸黏膜;(3)infl組:炎癥結(jié)腸黏膜。 結(jié)果:①UC患者35例,男19例,女16例。UC組輕度8例,中度18例,重度9例。②CYP27B1炎癥黏膜組明顯高于對(duì)照組(8.62±1.19 vs 5.14±0.86,P 0.01)及非炎癥黏膜組(8.62±1.19 vs 5.86±0.74,P0.05)后兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.86±0.74 vs 5.14±0.86,P 0.05);HBD-1在對(duì)照組及UC患者結(jié)腸上皮均有表達(dá),對(duì)照組顯著高于UC患者非炎癥部位和炎癥部位(7.28±0.93 vs 5.29±1.03,P 0.05;7.28±0.93 vs 4.47±1.24, P 0.01 );HBD-2在炎癥部位顯著高表達(dá),與對(duì)照組比較(7.41±1.32 vs 3.46±0.81,P 0.01)及非炎癥部位比較(7.41±1.32 vs 3.55±1.15,P 0.01)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)表明,炎癥黏膜組織中CYP27B1的表達(dá)與HBD-2的表達(dá)呈高度正相關(guān)(r=0.710,P0.01);③應(yīng)用real-time Q-PCR技術(shù)檢測(cè)各組CYP27B1、HBD-1和HBD-2的mRNA表達(dá),并采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較上述指標(biāo)在各組結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)。以con組為對(duì)照組(其CYP27B1、HBD-1和HBD-2的mRNA表達(dá)量均為1),則uninfl組與infl組中CYP27B1 mRNA的表達(dá)量分別為1.355、5.559,HBD-1 mRNA的表達(dá)量分別為0.716、0.595,HBD-2的mRNA表達(dá)量分別為1.810、10.286。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:infl組中CYP27B1、HBD2的mRNA的表達(dá)明顯高于Con組(P0.01,P0.01),而HBD1的mRNA表達(dá)較con組顯著降低(P 0.01);④Western blot分析CYP27B1蛋白在各組中的表達(dá),結(jié)果顯示:infl組(1.22±0.10)顯著高于con組(0.84±0.06)及uninfl組(0.99±0.19),P0.05;而HBD-1蛋白在infl組(0.77±0.07)的表達(dá)顯著低于con組(1.66±0.10)及uninfl組(1.39±0.10),P0.05,P0.01;HBD-2蛋白在infl組(0.87±0.04)的表達(dá)顯著高于con組(0.11±0.04)及uninfl組(0.20±0.07),P0.01,P0.01。 結(jié)論:①CYP27B1,HBD-1和HBD-2在正常對(duì)照組織和非炎癥黏膜組織及炎癥黏膜組織中的表達(dá)有顯著差異,其中CYP27B1和HBD-2在UC病變部位顯著高表達(dá),而HBD-1在UC患者正常及病變黏膜均低表達(dá)。提示三者可能參與了UC發(fā)病的病理過(guò)程;②UC患者病變部位HBD-2表達(dá)和CYP27B1的表達(dá)呈顯著正相關(guān),而HBD-1和CYP27B1的關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步證實(shí)。 第二部分CYP27B1腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外促進(jìn)防御素表達(dá)的效應(yīng)觀(guān)察 目的:探討CYP27B1過(guò)表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞HBD-1及HBD-2的調(diào)控作用。 方法:①重組腺病毒Ad-CYP27B1的構(gòu)建:從Caco-2細(xì)胞提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因CYP27B1片段,克隆至pTA2克隆載體,將測(cè)序正確的CYP27B1亞克隆至pAdTrack-CMV中后轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的感受態(tài)BJ5183,通過(guò)同源重組獲得腺病毒載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293包裝病毒顆粒;②采用real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot方法檢測(cè)被感染的Caco-2細(xì)胞中CYP27B1的mRNA和蛋白表達(dá)以證實(shí)重組腺病毒Ad-CYP27B1的成功構(gòu)建;③采用過(guò)表達(dá)策略,以腺病毒為載體,將Ad-CYP27B1及對(duì)照空病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞,分別采用real-time Q-PCR技術(shù)及Western blot檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中HBD-1及HBD-2在mRNA、蛋白表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)con組,以含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,在感染步驟加入無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM代替病毒液;(2)Ad-GFP組,感染表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP;(3)Ad-CYP27B1組,感染攜帶CYP27B1基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-CYP27B1。 結(jié)果:①重組腺病毒CYP27B1的構(gòu)建:成功擴(kuò)增出1527bp大小的CYP27B1片段,經(jīng)測(cè)序與預(yù)期序列一致,將測(cè)序正確的CYP27B1成功克隆至pAdTrack-CYP27B1后,與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)同源重組,通過(guò)篩選、293細(xì)胞包裝后獲得了重組腺病毒Ad-CYP27B1,病毒滴度約為1011U/ mL②腺病毒感染Caco-2細(xì)胞后48 h,應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)Caco-2細(xì)胞CYP27B1 mRNA表達(dá),并采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較CYP27B1 mRNA在各組Caco-2細(xì)胞中的表達(dá)。以con組為對(duì)照組(其CYP27B1 mRNA表達(dá)量為1),Ad-CYP27B1組CYP27B1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.135,顯著高于Con組(P0.01),而Ad-GFP組的CYP27B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.886,與Con組無(wú)顯著差異(P0.05);進(jìn)一步應(yīng)用Western blot分析各組Caco-2細(xì)胞的CYP27B1蛋白表達(dá),Ad-CYP27B1組(2.09±0.05)顯著高于con組(1.52±0.09)及Ad-GFP組(1.35±0.13),P0.01。Ad-GFP組與con組間CYP27B1蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異(P0.05),證明重組腺病毒Ad-CYP27B1成功感染體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞。③病毒感染Caco-2細(xì)胞后細(xì)胞狀態(tài)良好,貼壁生長(zhǎng),無(wú)變圓、縮小或脫落等病理跡象,經(jīng)過(guò)熒光倒置顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)Ad-CYP27B1的轉(zhuǎn)染效率在第24 h約48%,48 h約80%。④為評(píng)價(jià)CYP27B1對(duì)HBD1和HBD2的影響,在病毒感染Caco-2細(xì)胞48 h后,采用real-time Q-PCR及Western blot檢測(cè)Caco-2細(xì)胞HBD1及HBD2在轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示Ad-CYP27B1組Caco2細(xì)胞HBD-1蛋白及其mRNA顯著高于Con組(P0.05);HBD-2蛋白及其mRNA顯著高于Con組(P0.01, P0.05). 結(jié)論: CYP27B1基因促進(jìn)了HBD-1及HBD-2在Caco-2細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá),從而可能增強(qiáng)結(jié)腸上皮的抗菌功能,對(duì)維持結(jié)腸黏膜屏障功能完整起到保護(hù)作用。 第三部分維生素D對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎維持緩解的作用 目的:潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是臨床常見(jiàn)復(fù)發(fā)性疾病,目前尚無(wú)滿(mǎn)意的緩解期治療措施,標(biāo)準(zhǔn)治療方案僅能將1年內(nèi)累積復(fù)發(fā)率降為50%,研究顯示UC發(fā)病和維生素D缺乏相關(guān)聯(lián),本研究的目的是對(duì)5-氨基水楊酸方案聯(lián)合維生素D對(duì)維持緩解的效果進(jìn)行前瞻、單盲的隨機(jī)對(duì)照觀(guān)察,探索其做為緩解期維持治療方案的可行性,為UC緩解期治療提供新的思路。 方法:將52例誘導(dǎo)緩解的潰瘍性結(jié)腸病人,隨機(jī)分為維生素D+美沙拉秦組(26人)和美沙拉秦組(26人),分別給予羅鈣全0.25μg 1/日+美沙拉秦500mg 3/日或單獨(dú)給予美沙拉秦500mg 3/日。終點(diǎn)事件為疾病復(fù)發(fā)。采用Kaplan - Meier法和Log rank檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。 結(jié)果:試驗(yàn)截尾,兩組之間的基本臨床資料、復(fù)發(fā)率及累積緩解率無(wú)顯著差異;對(duì)兩組高復(fù)發(fā)率患者進(jìn)行分層統(tǒng)計(jì)后,兩組間緩解時(shí)間(V+M組,224±39天;MSL組134±27天,Student t test P=0.026)和累積緩解率(Log-rank test P =0.039)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論:維生素D聯(lián)合美沙拉秦不能顯著降低一般患者的累積復(fù)發(fā)率,但對(duì)高復(fù)發(fā)率患者,可能延長(zhǎng)其緩解時(shí)間及累積緩解率。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R574.62

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬亦e

本文編號(hào)：2800029