發(fā)布時(shí)間：2020-08-19 17:00

【摘要】： 血吸蟲(chóng)病是一種世界性的主要公共衛(wèi)生疾病,流行于全球74個(gè)國(guó)家和地區(qū),主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲。我國(guó)歷經(jīng)半個(gè)多世紀(jì)的積極防治取得了巨大的成績(jī),但是近年來(lái),我國(guó)血吸蟲(chóng)病有卷土重來(lái)之勢(shì)。目前全國(guó)共有血吸蟲(chóng)病人67萬(wàn)多人,主要是慢性和晚期血吸蟲(chóng)病人(慢血和晚血)。慢血病人多發(fā)生肝纖維化繼而發(fā)展為晚血的肝硬化,治愈非常棘手。 血吸蟲(chóng)病是一種免疫性疾病。血吸蟲(chóng)不同蟲(chóng)期釋放的抗原均能誘發(fā)宿主的免疫應(yīng)答,尤以蟲(chóng)卵引起的肝腸蟲(chóng)卵肉芽腫最為嚴(yán)重,并進(jìn)而發(fā)生纖維化、甚至硬化,是慢血和晚血病人的主要病理表現(xiàn)。由此導(dǎo)致的肝脾腫大、門脈高壓和其他并發(fā)癥是晚血病人死亡的主要原因。肝纖維化的治療涉及祛除病因、抗氧化抗炎、調(diào)節(jié)肝臟膠原代謝、改善微循環(huán)及代謝障礙、減少并發(fā)癥(如門脈高壓等)等諸多環(huán)節(jié),現(xiàn)今尚缺乏很有效的抗纖維化藥物及方法。因此,探索阻遏肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的新途徑、新方法,不僅對(duì)血吸蟲(chóng)病肝纖維化,而且對(duì)其他慢性肝病引起的肝纖維化的治療都極具價(jià)值。 肝纖維化是肝臟對(duì)多種病因慢性刺激所致的損傷后修復(fù)反應(yīng),其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過(guò)度沉積。CD4~+T細(xì)胞在纖維化發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其亞型作用不同并相互抑制�；蛐酒芯恳啾砻�,Th1與Th2極化在慢性炎癥反應(yīng)中呈現(xiàn)不同的基因表達(dá)類別。Th1型極化主要涉及急性期反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,Th1型應(yīng)答的持續(xù)進(jìn)行可造成大量細(xì)胞死亡及組織損傷,主要細(xì)胞因子如IFN-γ。與之相反,Th2型極化涉及損傷修復(fù)與纖維化反應(yīng),主要細(xì)胞因子如IL-4,IL-5和IL-13。研究集中在如下基因中,如Ⅰ型溶膠原、Ⅲ型溶膠原、精氨酸酶、賴氨酰、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)。許多研究證明,與曼氏血吸蟲(chóng)的研究報(bào)道相似,日本血吸蟲(chóng)感染小鼠同樣存在Th1-Th2免疫漂移現(xiàn)象:Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ)與血吸蟲(chóng)肉芽腫的誘導(dǎo)和形成密切相關(guān),而Th2型細(xì)胞因子(如IL-4,IL-13)可抑制Th1型細(xì)胞因子,在纖維化進(jìn)程中起重要作用。因此在肝纖維化形成過(guò)程中,如何上調(diào)Th1型應(yīng)答以恢復(fù)機(jī)體正常的Th1/Th2應(yīng)答平衡,對(duì)預(yù)防、減輕甚至阻止肝纖維化的進(jìn)程可能將起到關(guān)鍵作用。 本室李光富、王新軍等先前在執(zhí)行國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目——“誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的日本血吸蟲(chóng)復(fù)合表位抗原對(duì)小鼠的保護(hù)作用的研究”(No.30271166)中,用C57BL/6(H-2b)小鼠從日本血吸蟲(chóng)疫苗候選分子Sj22.6(表膜抗原)、Sj28GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、SjTPI(磷酸丙糖異構(gòu)酶)、Si97(副肌球蛋白)中分別篩選并鑒定出Th1型P4和P6,以及多個(gè)T細(xì)胞表位,本研究中進(jìn)一步鑒定其中誘導(dǎo)較強(qiáng)Th1型應(yīng)答的抗原表位P18、P22。先前也已篩選出種屬特異性強(qiáng)、引發(fā)C57BL/6小鼠高Th1型應(yīng)答的免疫佐劑CpG ODN1826。 本研究借鑒PDDV(peptide-DNA dual vaccine)技術(shù),將Th1型表位肽P4、P6、P18、P22分別與含相應(yīng)編碼DNA和佐劑CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide)1826的重組質(zhì)粒結(jié)合而制備混合多價(jià)疫苗PDDV,以期用混合PDDV免疫小鼠,上調(diào)其Th1型應(yīng)答,誘導(dǎo)內(nèi)源性IFN-γ產(chǎn)生,從而最終達(dá)到下調(diào)血吸蟲(chóng)病肝纖維化的目的。 第一部分:進(jìn)一步鑒定日本血吸蟲(chóng)磷酸丙糖異構(gòu)酶和副肌球蛋白的Th1型表位,為構(gòu)建復(fù)合多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。 磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)是WHO/TDR提出的針對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)(Sehistosoma mansoni,Sm)的6個(gè)最具潛力的疫苗候選分子之一。Reynolds等發(fā)現(xiàn)重組的TPI(rTPI)在較強(qiáng)的Th2微環(huán)境下仍可誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子,并從SmTPI序列中進(jìn)一步篩選出了C57BL/6J小鼠特異的T細(xì)胞表位SmTPI-P18,以及CBA小鼠而非C57BL/6J小鼠特異性的T細(xì)胞表位SmTPI-P9。日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株的TPI(SjTPI)與SmTPI有84%的同源性,成蟲(chóng)來(lái)源的TPI、重組rSjTPI以及SjTPI DNA疫苗等多種形式都顯示了較好的抗感染和一定的抗病理?yè)p傷作用。先前王新軍等根據(jù)Reynolds等報(bào)道的SmTPI-P18及SmTPI-P9,設(shè)計(jì)了SjTPI同源序列部分的相應(yīng)表位SjTPI-P18及對(duì)照表位SjTPI-P9,并已鑒定SjTPI-P18是C57BL/6J小鼠特異的T細(xì)胞表位。本研究中用重組rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激經(jīng)重組rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞,檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平;再用高純度的合成表位肽SiTPI-P18刺激經(jīng)SjTPI-P18加完全弗氏佐劑(CFA)免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞,檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平。 副肌球蛋白是人和家畜多種寄生蟲(chóng)的候選疫苗抗原,曼氏血吸蟲(chóng)副肌球蛋白(Sm97)也是WHO確定的6個(gè)最具潛力的疫苗候選分子之一。副肌球蛋白能激發(fā)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫,其誘導(dǎo)的抗感染免疫保護(hù)力與其誘導(dǎo)機(jī)體Th1/Th2型免疫應(yīng)答向Th1型偏移的程度及水平成正相關(guān),同時(shí)具有一定的抗蟲(chóng)卵肉芽腫及肝纖維化作用。王新軍等用SYFPEITHI軟件預(yù)測(cè)Sj97的5個(gè)T細(xì)胞表位,重組并表達(dá)為硫氧還蛋白(TRX)融合蛋白,用此融合蛋白體外刺激C3H/HeJ和C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞,通過(guò)~3H-TdR摻入法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)P22刺激C57BL/6小鼠致敏淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)最高,提示P22可能是Sj97較好的T細(xì)胞表位。本研究中用人工合成肽Sj97-P22刺激經(jīng)Sj97-P22加弗氏佐劑免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞,采用~3H-TdR摻入法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖效果;ELISA法檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、IL-4水平。 結(jié)果:SjTPI-P18及rSjTPI-P18均可刺激經(jīng)rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平升高(P均＜0.05)及IL-4水平降低;SjTPI-P18可刺激經(jīng)SjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平升高及IL-4水平降低(P均＜0.05)。因此,SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特異的Th1型表位,而且在相同免疫劑量情況下人工合成肽的免疫原性優(yōu)于重組肽。Sj97表位鑒定中,Sj97-P22可刺激經(jīng)Sj97-P22免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞增殖,其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ分泌水平升高(P均＜0.05),IL-4分泌水平降低。因而表明Sj97-P22也是C57BL/6小鼠特異的Th1型表位。 第二部分:借鑒PDDV技術(shù),用篩選鑒定出的Th1型抗原表位P4、P6、P18、P22及Th1型免疫佐劑CpG ODN1826,構(gòu)建混合PDDV并進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。 PDDV是Wu YZ等首先在治療乙肝病毒的研究中構(gòu)建的一個(gè)新的疫苗形式,借鑒基因治療方法中陽(yáng)離子肽作為DNA的非病毒載體的技術(shù),將表位肽疫苗和DNA疫苗結(jié)合構(gòu)建的一種新的疫苗形式。本研究第一部分及本室先前工作已經(jīng)從疫苗候選分子中共篩選鑒定了4個(gè)Th1型表位肽——P4、P6、P18、P22,還篩選出種屬特異性強(qiáng)、引發(fā)C57BL/6小鼠高Th1型應(yīng)答的免疫佐劑CpG ODN1826。我們借鑒PDDV技術(shù),設(shè)計(jì)在pCI-neo表達(dá)載體中重組含有Th1型抗原表位基因和誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答的免疫佐劑CpG ODN1826的核苷酸序列,并合成18個(gè)賴氨酸與其相應(yīng)表位肽抗原的陽(yáng)離子聚合物,在特定條件下使陽(yáng)離子聚合物吸附在含有抗原表位和佐劑的重組載體周圍,成功制備了符合要求的顆粒狀PDDV。本研究進(jìn)一步觀察4個(gè)表位肽等量混合物刺激經(jīng)4種PDDV等量混合物免疫小鼠后的淋巴細(xì)胞增殖效果及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ和IL-4分泌水平,并觀察混合PDDV的免疫原性及誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)Th1型應(yīng)答的特征。 結(jié)果:通過(guò)沉淀試驗(yàn)得出陽(yáng)離子肽能夠有效結(jié)合DNA的鹽濃度范圍;阻滯試驗(yàn)及DNaseⅠ消化試驗(yàn)得出陽(yáng)離子肽有效保護(hù)DNA免受DNA酶降解的較適鹽濃度及電荷比值(r)條件;用透射電鏡觀察證實(shí):在r=4、150 mM NaCl、40 mM HEPES時(shí)可以獲得形態(tài)均一、直徑約為20 nm的符合要求的PDDV顆粒。在用P4、P6、P18、P22分別制備的4種PDDV等量混合物免疫C57BL/6小鼠后,觀察到P4、P6、P18、P22表位肽等量混合物可刺激免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖,分泌IL-2和IFN-γ水平升高(P均＜0.05),IL-4水平降低。本研究初步證實(shí):混合PDDV可優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠體內(nèi)的Th1型免疫應(yīng)答,刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的內(nèi)源性IFN-γ,為進(jìn)一步觀察混合PDDV對(duì)血吸蟲(chóng)慢性感染小鼠肝纖維化下調(diào)作用的影響奠定基礎(chǔ)。 第三部分:混合抗原表位PDDV對(duì)血吸蟲(chóng)感染小鼠肝纖維化下調(diào) 作用的研究 肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展涉及多種復(fù)雜因素的刺激和調(diào)節(jié),其根本原因是膠原的合成多于降解。主要的膠原生成細(xì)胞是肝星狀細(xì)胞(HSC),而且纖維生成和溶解中基質(zhì)重建的主要成分是基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(MMPs/TIMPs),MMP-9/TIMP-1平衡起關(guān)鍵作用。眾多研究表明,Th2型細(xì)胞因子能夠下調(diào)MMP-9/TIMP-1表達(dá)的平衡致使ECM沉積增多,并通過(guò)對(duì)HSC活化的調(diào)節(jié)等諸多關(guān)鍵環(huán)節(jié)促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。而以IFN-γ為主的Th1型細(xì)胞因子則能通過(guò)多種途徑抑制已活化的HSC,使其向靜息型轉(zhuǎn)變,并雙相調(diào)節(jié)MMP-9,主要對(duì)纖維化起下調(diào)作用。血吸蟲(chóng)感染后形成蟲(chóng)卵肉芽腫直至發(fā)生肝纖維化,存在著Th1型應(yīng)答向Th2型應(yīng)答漂移現(xiàn)象而使Th1/Th2平衡紊亂。因此通過(guò)上調(diào)Th1型應(yīng)答恢復(fù)Th1/Th2平衡,上調(diào)MMP-9/TIMP-1平衡,從而抑制HSC活化,促使ECM的溶解和重建,對(duì)減輕肝纖維化發(fā)展有著重要意義。 在第二部分研究中,已經(jīng)成功構(gòu)建能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)Th1型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的混合PDDV,本部分的研究旨在用此混合PDDV免疫日本血吸蟲(chóng)感染14w并經(jīng)吡喹酮治療的C57BL/6小鼠,通過(guò)最直觀的肝臟病理學(xué)指標(biāo)(肝纖維化評(píng)分、肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積)觀察其肝纖維化程度變化;通過(guò)免疫組化觀察HSCs活化標(biāo)志物α-SMA、膠原及相關(guān)酶譜CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1、MMP-9以及細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)情況;通過(guò)RT-PCR方法觀察α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、IL-4、IL-13、TGF-β1、IFN-γ在mRNA水平上的表達(dá)豐度;通過(guò)檢測(cè)血清中IFN-γ和IL-4含量以及SWAP特異的抗體IgG、IgG1、IgG2a和IgG1/IgG2a比值以觀察不同時(shí)間點(diǎn)(0 w,10 w,14 w,25 w)免疫小鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答的變化。并試圖探討混合PDDV對(duì)血吸蟲(chóng)慢性感染小鼠肝纖維化形成過(guò)程中肝纖維化發(fā)展產(chǎn)生影響的原因。 結(jié)果:混合表位-CpG PDDV組小鼠肝臟的纖維化程度減輕,肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積減小;免疫組化結(jié)果顯示肝臟的α-SMA、CollagenⅠ、TIMP-1表達(dá)下降,肝臟的MMP-9表達(dá)升高,與溶劑對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且肝臟的IFN-γ表達(dá)水平升高以及CollagenⅢ表達(dá)水平下降,但與溶劑對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。半定量RT-PCR顯示觀察肝臟組織膠原和細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn),混合表位-CpG PDDV組的α-SMA、CollagenⅢ、TGF-β1、IL-4、IL-13的mRNA表達(dá)水平下降與溶劑對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而CollagenⅠ的mRNA表達(dá)水平下降及IFN-γ的mRNA表達(dá)水平上升,與溶劑對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清細(xì)胞因子檢測(cè)顯示,混合表位-CpG PDDv免疫組小鼠血清中分泌IFN-γ水平在治療后顯著增高(P＜0.05),分泌IL-4水平未見(jiàn)明顯變化,第25w時(shí)以混合表位-CpG PDDV組分泌IFN-γ水平為最高,但各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清中SWAP特異的抗體IgG、IgG1、IgG2a檢測(cè)顯示,混合表位-CpG PDDV組的IgG、IgG2a水平隨時(shí)間點(diǎn)逐漸上升,IgG1水平在第14 w比第10 w顯著上升但第25 w與第14 w水平接近,第25 w的IgG1/IgG2a比值比第14 w降低。 綜上,本研究觀察到混合表位-CpG PDDV免疫的血吸蟲(chóng)慢性感染小鼠,其匯管區(qū)及蟲(chóng)卵肉芽腫周圍纖維增生和炎性浸潤(rùn)明顯減輕,肝纖維化程度減輕;肝臟細(xì)胞因子IL-4、IL-13、TGF-βmRNA水平顯著下降,IFN-γmRNA水平上升;肝臟的蛋白表達(dá)水平上,IFN-γ表達(dá)相應(yīng)增高,MMP-9表達(dá)明顯增高,TIMP-1表達(dá)明顯下降;血清細(xì)胞因子和抗體檢測(cè)都顯示了Th1/Th2上調(diào)現(xiàn)象。并同時(shí)觀察到混合表位-CpG PDDV免疫后小鼠肝臟α-SMA在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)量均顯著降低,Ⅰ型、Ⅲ型膠原在蛋白和mRNA水平上表達(dá)量均減少,提示混合表位-CpG PDDV可抑制HSC的激活并減少Ⅰ、Ⅲ型膠原的產(chǎn)生。 因此,混合表位-CpG PDDV可能是通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)IFN-γ為主的Th1型應(yīng)答促進(jìn)Th1/Th2平衡上調(diào),從而使MMP-9/TIMP-1的平衡上調(diào);并調(diào)控HSC的活化及ECM的生成,導(dǎo)致對(duì)肝纖維化的下調(diào)作用。 本研究已成功制備了可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高水平IFN-γ的呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)Th1型應(yīng)答的混合多價(jià)疫苗——混合表位-CpGPDDV;并觀察到其能減輕血吸蟲(chóng)慢性感染小鼠肝纖維化的發(fā)展,對(duì)其他因素引起的肝纖維化的下調(diào)研究亦具重要意義。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R532.2;R575.2
【圖文】：

較rsjTPI一P9為低。rsjTPI一P18及SjTPI一P18誘導(dǎo)的IFN一Y水平分別為(36.5士9.5)pg/ml和(46.3士16.5)pg/ml，rsjTpl一pg誘導(dǎo)的IFN一丫為(21.7士6.1)pg/ml，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);rsjTpl一pls與SjTPI一P18比較，誘導(dǎo)的IFN一丫水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)(圖4)。(3)為進(jìn)一步觀察高純度的合成表位膚sjTPI一P18免疫原性和誘導(dǎo)Thl型應(yīng)答的潛能，本部分研究中用SjTPI一P18免疫C57BL/6小鼠，lw后加強(qiáng)免疫，7d后取脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)并用SjTPI一P18表位膚刺激，可使脾淋巴細(xì)胞分泌高水平的IFN一丫及低水平的IL一4，分別為(22.8士4.9)p目ml和(0.9士0.2)pg加1:pBS對(duì)照組分別為(5.4士4.4)pg/ml和(1.3士0.3)pg/ml，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.05)(圖SA、B);PBs對(duì)照組淋巴細(xì)胞IFN一丫及IL一4水平無(wú)顯著變化(圖SC、D)o

注:與PBS比較，*P<0.05;**P<0.01圖5SjTpl一p18對(duì)經(jīng)SjTpl一p18(A，B)或pBS(C，D)免疫2次的C57BL/6鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN一Y(A、C)及IL一4(B、D)的作用3、合成膚Sj97一P22免疫2次后小鼠的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果合成膚Sj97一P22可刺激sj97一P22免疫2次的C57BL/6小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞增殖(SI>2)(圖6)，而PBS免疫組刺激的SI值<2。4.53.52.5測(cè)曰的15

本文編號(hào)：2797341