【摘要】： 血吸蟲病是一種世界性的主要公共衛(wèi)生疾病,流行于全球74個國家和地區(qū),主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲。我國歷經半個多世紀的積極防治取得了巨大的成績,但是近年來,我國血吸蟲病有卷土重來之勢。目前全國共有血吸蟲病人67萬多人,主要是慢性和晚期血吸蟲病人(慢血和晚血)。慢血病人多發(fā)生肝纖維化繼而發(fā)展為晚血的肝硬化,治愈非常棘手。 血吸蟲病是一種免疫性疾病。血吸蟲不同蟲期釋放的抗原均能誘發(fā)宿主的免疫應答,尤以蟲卵引起的肝腸蟲卵肉芽腫最為嚴重,并進而發(fā)生纖維化、甚至硬化,是慢血和晚血病人的主要病理表現(xiàn)。由此導致的肝脾腫大、門脈高壓和其他并發(fā)癥是晚血病人死亡的主要原因。肝纖維化的治療涉及祛除病因、抗氧化抗炎、調節(jié)肝臟膠原代謝、改善微循環(huán)及代謝障礙、減少并發(fā)癥(如門脈高壓等)等諸多環(huán)節(jié),現(xiàn)今尚缺乏很有效的抗纖維化藥物及方法。因此,探索阻遏肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的新途徑、新方法,不僅對血吸蟲病肝纖維化,而且對其他慢性肝病引起的肝纖維化的治療都極具價值。 肝纖維化是肝臟對多種病因慢性刺激所致的損傷后修復反應,其特征是細胞外基質(ECM)的過度沉積。CD4~+T細胞在纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用,其亞型作用不同并相互抑制�；蛐酒芯恳啾砻�,Th1與Th2極化在慢性炎癥反應中呈現(xiàn)不同的基因表達類別。Th1型極化主要涉及急性期反應和細胞凋亡,Th1型應答的持續(xù)進行可造成大量細胞死亡及組織損傷,主要細胞因子如IFN-γ。與之相反,Th2型極化涉及損傷修復與纖維化反應,主要細胞因子如IL-4,IL-5和IL-13。研究集中在如下基因中,如Ⅰ型溶膠原、Ⅲ型溶膠原、精氨酸酶、賴氨酰、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)。許多研究證明,與曼氏血吸蟲的研究報道相似,日本血吸蟲感染小鼠同樣存在Th1-Th2免疫漂移現(xiàn)象:Th1型細胞因子(如IFN-γ)與血吸蟲肉芽腫的誘導和形成密切相關,而Th2型細胞因子(如IL-4,IL-13)可抑制Th1型細胞因子,在纖維化進程中起重要作用。因此在肝纖維化形成過程中,如何上調Th1型應答以恢復機體正常的Th1/Th2應答平衡,對預防、減輕甚至阻止肝纖維化的進程可能將起到關鍵作用。 本室李光富、王新軍等先前在執(zhí)行國家自然科學基金項目——“誘導Th1應答的日本血吸蟲復合表位抗原對小鼠的保護作用的研究”(No.30271166)中,用C57BL/6(H-2b)小鼠從日本血吸蟲疫苗候選分子Sj22.6(表膜抗原)、Sj28GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)、SjTPI(磷酸丙糖異構酶)、Si97(副肌球蛋白)中分別篩選并鑒定出Th1型P4和P6,以及多個T細胞表位,本研究中進一步鑒定其中誘導較強Th1型應答的抗原表位P18、P22。先前也已篩選出種屬特異性強、引發(fā)C57BL/6小鼠高Th1型應答的免疫佐劑CpG ODN1826。 本研究借鑒PDDV(peptide-DNA dual vaccine)技術,將Th1型表位肽P4、P6、P18、P22分別與含相應編碼DNA和佐劑CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide)1826的重組質粒結合而制備混合多價疫苗PDDV,以期用混合PDDV免疫小鼠,上調其Th1型應答,誘導內源性IFN-γ產生,從而最終達到下調血吸蟲病肝纖維化的目的。 第一部分:進一步鑒定日本血吸蟲磷酸丙糖異構酶和副肌球蛋白的Th1型表位,為構建復合多價疫苗奠定基礎。 磷酸丙糖異構酶(TPI)是WHO/TDR提出的針對曼氏血吸蟲(Sehistosoma mansoni,Sm)的6個最具潛力的疫苗候選分子之一。Reynolds等發(fā)現(xiàn)重組的TPI(rTPI)在較強的Th2微環(huán)境下仍可誘導產生Th1型細胞因子,并從SmTPI序列中進一步篩選出了C57BL/6J小鼠特異的T細胞表位SmTPI-P18,以及CBA小鼠而非C57BL/6J小鼠特異性的T細胞表位SmTPI-P9。日本血吸蟲中國大陸株的TPI(SjTPI)與SmTPI有84%的同源性,成蟲來源的TPI、重組rSjTPI以及SjTPI DNA疫苗等多種形式都顯示了較好的抗感染和一定的抗病理損傷作用。先前王新軍等根據Reynolds等報道的SmTPI-P18及SmTPI-P9,設計了SjTPI同源序列部分的相應表位SjTPI-P18及對照表位SjTPI-P9,并已鑒定SjTPI-P18是C57BL/6J小鼠特異的T細胞表位。本研究中用重組rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激經重組rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞,檢測其細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平;再用高純度的合成表位肽SiTPI-P18刺激經SjTPI-P18加完全弗氏佐劑(CFA)免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞,檢測其細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平。 副肌球蛋白是人和家畜多種寄生蟲的候選疫苗抗原,曼氏血吸蟲副肌球蛋白(Sm97)也是WHO確定的6個最具潛力的疫苗候選分子之一。副肌球蛋白能激發(fā)較強的體液免疫和細胞免疫,其誘導的抗感染免疫保護力與其誘導機體Th1/Th2型免疫應答向Th1型偏移的程度及水平成正相關,同時具有一定的抗蟲卵肉芽腫及肝纖維化作用。王新軍等用SYFPEITHI軟件預測Sj97的5個T細胞表位,重組并表達為硫氧還蛋白(TRX)融合蛋白,用此融合蛋白體外刺激C3H/HeJ和C57BL/6小鼠淋巴細胞,通過~3H-TdR摻入法檢測,發(fā)現(xiàn)P22刺激C57BL/6小鼠致敏淋巴細胞的增殖指數最高,提示P22可能是Sj97較好的T細胞表位。本研究中用人工合成肽Sj97-P22刺激經Sj97-P22加弗氏佐劑免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞,采用~3H-TdR摻入法檢測淋巴細胞的增殖效果;ELISA法檢測其細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、IL-4水平。 結果:SjTPI-P18及rSjTPI-P18均可刺激經rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ水平升高(P均＜0.05)及IL-4水平降低;SjTPI-P18可刺激經SjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ水平升高及IL-4水平降低(P均＜0.05)。因此,SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特異的Th1型表位,而且在相同免疫劑量情況下人工合成肽的免疫原性優(yōu)于重組肽。Sj97表位鑒定中,Sj97-P22可刺激經Sj97-P22免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞增殖,其細胞培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ分泌水平升高(P均＜0.05),IL-4分泌水平降低。因而表明Sj97-P22也是C57BL/6小鼠特異的Th1型表位。 第二部分:借鑒PDDV技術,用篩選鑒定出的Th1型抗原表位P4、P6、P18、P22及Th1型免疫佐劑CpG ODN1826,構建混合PDDV并進行免疫學鑒定。 PDDV是Wu YZ等首先在治療乙肝病毒的研究中構建的一個新的疫苗形式,借鑒基因治療方法中陽離子肽作為DNA的非病毒載體的技術,將表位肽疫苗和DNA疫苗結合構建的一種新的疫苗形式。本研究第一部分及本室先前工作已經從疫苗候選分子中共篩選鑒定了4個Th1型表位肽——P4、P6、P18、P22,還篩選出種屬特異性強、引發(fā)C57BL/6小鼠高Th1型應答的免疫佐劑CpG ODN1826。我們借鑒PDDV技術,設計在pCI-neo表達載體中重組含有Th1型抗原表位基因和誘導Th1型應答的免疫佐劑CpG ODN1826的核苷酸序列,并合成18個賴氨酸與其相應表位肽抗原的陽離子聚合物,在特定條件下使陽離子聚合物吸附在含有抗原表位和佐劑的重組載體周圍,成功制備了符合要求的顆粒狀PDDV。本研究進一步觀察4個表位肽等量混合物刺激經4種PDDV等量混合物免疫小鼠后的淋巴細胞增殖效果及淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ和IL-4分泌水平,并觀察混合PDDV的免疫原性及誘導優(yōu)勢Th1型應答的特征。 結果:通過沉淀試驗得出陽離子肽能夠有效結合DNA的鹽濃度范圍;阻滯試驗及DNaseⅠ消化試驗得出陽離子肽有效保護DNA免受DNA酶降解的較適鹽濃度及電荷比值(r)條件;用透射電鏡觀察證實:在r=4、150 mM NaCl、40 mM HEPES時可以獲得形態(tài)均一、直徑約為20 nm的符合要求的PDDV顆粒。在用P4、P6、P18、P22分別制備的4種PDDV等量混合物免疫C57BL/6小鼠后,觀察到P4、P6、P18、P22表位肽等量混合物可刺激免疫小鼠淋巴細胞增殖,分泌IL-2和IFN-γ水平升高(P均＜0.05),IL-4水平降低。本研究初步證實:混合PDDV可優(yōu)勢誘導C57BL/6小鼠體內的Th1型免疫應答,刺激機體產生高水平的內源性IFN-γ,為進一步觀察混合PDDV對血吸蟲慢性感染小鼠肝纖維化下調作用的影響奠定基礎。 第三部分:混合抗原表位PDDV對血吸蟲感染小鼠肝纖維化下調 作用的研究 肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展涉及多種復雜因素的刺激和調節(jié),其根本原因是膠原的合成多于降解。主要的膠原生成細胞是肝星狀細胞(HSC),而且纖維生成和溶解中基質重建的主要成分是基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶抑制因子(MMPs/TIMPs),MMP-9/TIMP-1平衡起關鍵作用。眾多研究表明,Th2型細胞因子能夠下調MMP-9/TIMP-1表達的平衡致使ECM沉積增多,并通過對HSC活化的調節(jié)等諸多關鍵環(huán)節(jié)促進肝纖維化發(fā)展。而以IFN-γ為主的Th1型細胞因子則能通過多種途徑抑制已活化的HSC,使其向靜息型轉變,并雙相調節(jié)MMP-9,主要對纖維化起下調作用。血吸蟲感染后形成蟲卵肉芽腫直至發(fā)生肝纖維化,存在著Th1型應答向Th2型應答漂移現(xiàn)象而使Th1/Th2平衡紊亂。因此通過上調Th1型應答恢復Th1/Th2平衡,上調MMP-9/TIMP-1平衡,從而抑制HSC活化,促使ECM的溶解和重建,對減輕肝纖維化發(fā)展有著重要意義。 在第二部分研究中,已經成功構建能夠誘導小鼠體內Th1型優(yōu)勢應答的混合PDDV,本部分的研究旨在用此混合PDDV免疫日本血吸蟲感染14w并經吡喹酮治療的C57BL/6小鼠,通過最直觀的肝臟病理學指標(肝纖維化評分、肝臟蟲卵肉芽腫面積)觀察其肝纖維化程度變化;通過免疫組化觀察HSCs活化標志物α-SMA、膠原及相關酶譜CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1、MMP-9以及細胞因子IFN-γ的表達情況;通過RT-PCR方法觀察α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、IL-4、IL-13、TGF-β1、IFN-γ在mRNA水平上的表達豐度;通過檢測血清中IFN-γ和IL-4含量以及SWAP特異的抗體IgG、IgG1、IgG2a和IgG1/IgG2a比值以觀察不同時間點(0 w,10 w,14 w,25 w)免疫小鼠體內細胞免疫及體液免疫應答的變化。并試圖探討混合PDDV對血吸蟲慢性感染小鼠肝纖維化形成過程中肝纖維化發(fā)展產生影響的原因。 結果:混合表位-CpG PDDV組小鼠肝臟的纖維化程度減輕,肝臟蟲卵肉芽腫面積減小;免疫組化結果顯示肝臟的α-SMA、CollagenⅠ、TIMP-1表達下降,肝臟的MMP-9表達升高,與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);且肝臟的IFN-γ表達水平升高以及CollagenⅢ表達水平下降,但與溶劑對照組比較無統(tǒng)計學意義。半定量RT-PCR顯示觀察肝臟組織膠原和細胞因子的mRNA表達水平時發(fā)現(xiàn),混合表位-CpG PDDV組的α-SMA、CollagenⅢ、TGF-β1、IL-4、IL-13的mRNA表達水平下降與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而CollagenⅠ的mRNA表達水平下降及IFN-γ的mRNA表達水平上升,與溶劑對照組比較無統(tǒng)計學意義。血清細胞因子檢測顯示,混合表位-CpG PDDv免疫組小鼠血清中分泌IFN-γ水平在治療后顯著增高(P＜0.05),分泌IL-4水平未見明顯變化,第25w時以混合表位-CpG PDDV組分泌IFN-γ水平為最高,但各組間比較無統(tǒng)計學意義。血清中SWAP特異的抗體IgG、IgG1、IgG2a檢測顯示,混合表位-CpG PDDV組的IgG、IgG2a水平隨時間點逐漸上升,IgG1水平在第14 w比第10 w顯著上升但第25 w與第14 w水平接近,第25 w的IgG1/IgG2a比值比第14 w降低。 綜上,本研究觀察到混合表位-CpG PDDV免疫的血吸蟲慢性感染小鼠,其匯管區(qū)及蟲卵肉芽腫周圍纖維增生和炎性浸潤明顯減輕,肝纖維化程度減輕;肝臟細胞因子IL-4、IL-13、TGF-βmRNA水平顯著下降,IFN-γmRNA水平上升;肝臟的蛋白表達水平上,IFN-γ表達相應增高,MMP-9表達明顯增高,TIMP-1表達明顯下降;血清細胞因子和抗體檢測都顯示了Th1/Th2上調現(xiàn)象。并同時觀察到混合表位-CpG PDDV免疫后小鼠肝臟α-SMA在蛋白和mRNA水平上的表達量均顯著降低,Ⅰ型、Ⅲ型膠原在蛋白和mRNA水平上表達量均減少,提示混合表位-CpG PDDV可抑制HSC的激活并減少Ⅰ、Ⅲ型膠原的產生。 因此,混合表位-CpG PDDV可能是通過誘導表達IFN-γ為主的Th1型應答促進Th1/Th2平衡上調,從而使MMP-9/TIMP-1的平衡上調;并調控HSC的活化及ECM的生成,導致對肝纖維化的下調作用。 本研究已成功制備了可誘導C57BL/6小鼠體內產生較高水平IFN-γ的呈現(xiàn)優(yōu)勢Th1型應答的混合多價疫苗——混合表位-CpGPDDV;并觀察到其能減輕血吸蟲慢性感染小鼠肝纖維化的發(fā)展,對其他因素引起的肝纖維化的下調研究亦具重要意義。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R532.2;R575.2
【圖文】：

較rsjTPI一P9為低。rsjTPI一P18及SjTPI一P18誘導的IFN一Y水平分別為(36.5士9.5)pg/ml和(46.3士16.5)pg/ml，rsjTpl一pg誘導的IFN一丫為(21.7士6.1)pg/ml，差異具統(tǒng)計學意義(p<0.05);rsjTpl一pls與SjTPI一P18比較，誘導的IFN一丫水平差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)(圖4)。(3)為進一步觀察高純度的合成表位膚sjTPI一P18免疫原性和誘導Thl型應答的潛能，本部分研究中用SjTPI一P18免疫C57BL/6小鼠，lw后加強免疫，7d后取脾淋巴細胞培養(yǎng)并用SjTPI一P18表位膚刺激，可使脾淋巴細胞分泌高水平的IFN一丫及低水平的IL一4，分別為(22.8士4.9)p目ml和(0.9士0.2)pg加1:pBS對照組分別為(5.4士4.4)pg/ml和(1.3士0.3)pg/ml，差異均具統(tǒng)計學意義(尸<0.05)(圖SA、B);PBs對照組淋巴細胞IFN一丫及IL一4水平無顯著變化(圖SC、D)o

注:與PBS比較，*P<0.05;**P<0.01圖5SjTpl一p18對經SjTpl一p18(A，B)或pBS(C，D)免疫2次的C57BL/6鼠淋巴細胞分泌IFN一Y(A、C)及IL一4(B、D)的作用3、合成膚Sj97一P22免疫2次后小鼠的淋巴細胞增殖試驗結果合成膚Sj97一P22可刺激sj97一P22免疫2次的C57BL/6小鼠的淋巴結細胞增殖(SI>2)(圖6)，而PBS免疫組刺激的SI值<2。4.53.52.5測曰的15

本文編號：2797341