【摘要】： 急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床上常見(jiàn)的急腹癥之一,特別是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis , SAP)并發(fā)癥多,預(yù)后兇險(xiǎn),病死率可高達(dá)30%～40%。急性肺損傷及其終末階段急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是AP最常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥,為臨床SAP病人死亡的重要原因之一。 神經(jīng)激肽P物質(zhì)是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì),在免疫反應(yīng)中亦起著重要作用。近年來(lái),P物質(zhì)在AP與其相關(guān)性肺損傷中的作用已被人們認(rèn)識(shí),并逐漸引起重視。已知P物質(zhì)是一種舒血管物質(zhì),能增加血管通透性,導(dǎo)致血漿滲出與水腫。P物質(zhì)能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附與浸潤(rùn),還能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生并與T細(xì)胞增殖,B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體及單核巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞釋放炎性介質(zhì),多形核白細(xì)胞呼吸爆發(fā)等功能作用相關(guān)。P物質(zhì)主要是通過(guò)與相應(yīng)神經(jīng)激肽受體(neurokinin-1 receptors, NK-1R)結(jié)合,介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)的第二信號(hào)途徑而發(fā)揮作用的。研究發(fā)現(xiàn),在AP過(guò)程中,P物質(zhì)釋放明顯增加,其相應(yīng)NK-1R表達(dá)亦明顯增加。反映肺組織血漿、炎細(xì)胞滲出程度的肺濕/干重率明顯增加,作為反映中性粒細(xì)胞聚集程度指標(biāo)的髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活力亦明顯增強(qiáng)。Lau等發(fā)現(xiàn)在雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎模型中通過(guò)腹腔給予P物質(zhì)受體拮抗劑CP-96,345可以降低血清淀粉酶水平,減輕胰腺與肺組織的水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷,降低MPO活性,降低微血管通透性,從而為AP相關(guān)性肺損傷的治療提供一新的途徑。 目的: 本研究通過(guò)建立大鼠AP模型,并施予P物質(zhì)受體拮抗劑L-703,606干預(yù),觀察肺組織的濕/干重比率,MPO活性,病理改變及P物質(zhì)與NK-1R的表達(dá)情況,探討其在AP炎癥反應(yīng)中的作用,探討L-703,606對(duì)實(shí)驗(yàn)性AP的治療作用及機(jī)制。 方法: 1動(dòng)物模型的制備:選取雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口進(jìn)入腹腔,用4號(hào)加工鈍頭頭皮靜脈針頭于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管,以0.2 ml/min速度注入5%�；悄懰徕c(0.1 ml/100g),推藥后捏閉胰膽管入十二指腸處,觀察3 min,剪除除結(jié)扎線,關(guān)腹。 2實(shí)驗(yàn)分組:將雄性Sprague-Dawley大鼠54只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組, n=18)、急性胰腺炎組(AP組, n=18)、急性胰腺炎治療組(AP+ L-703,606組, n=18),后又以不同時(shí)間點(diǎn)3 h、6 h、12 h分為三個(gè)亞組,每個(gè)亞組為6只大鼠。AP+ L-703,606組于不同時(shí)間點(diǎn)造模前15 min經(jīng)尾靜脈預(yù)防性注射L-703,606(250 nmol /kg)。 3肺組織濕/干重率測(cè)定:取左肺葉,以吸水紙吸干表面液體,稱取濕重,置于60°C烤箱烤72 h至恒重,稱取干重,計(jì)算濕/干重比率。 4生化指標(biāo)測(cè)定:取血清樣本,采用全自動(dòng)血清生化分析儀檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶,由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生化室協(xié)助測(cè)定。 5胰腺、肺組織學(xué)檢查:采用石蠟切片,HE染色。 6 MPO活力測(cè)定:取肺組織制成組織勻漿,用化學(xué)比色法測(cè)定,具體操作按南京建成生物工程研究所提供的測(cè)試盒說(shuō)明書進(jìn)行。 7免疫組織化學(xué)染色:脫蠟至水,抗原熱修復(fù)后,用3%過(guò)氧化氫孵育15 min。封閉一抗4°C過(guò)夜,陰性對(duì)照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15 min,后用3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色,復(fù)染后封片。以細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。 8 western blot: 100 mg肺組織經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)徹底粉碎,加入1 ml細(xì)胞裂解液,充分裂解,提取NK-1R膜蛋白(具體操作按說(shuō)明書),取20μg與上樣緩沖液充分混合,置于SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至NC膜,以5%的脫脂奶粉封閉,一抗(1:250) 4°C孵育過(guò)夜,以相應(yīng)的二抗室溫下孵育2 h,抗體檢測(cè)按Santa Cruz公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。 結(jié)果: 1大鼠胰腺的病理學(xué)變化:肉眼和光鏡所見(jiàn)SO組胰腺及周圍組織結(jié)構(gòu)始終大致正常;AP組和AP+L-703,606組隨著時(shí)間的推移,胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死面積逐漸擴(kuò)大,程度逐漸加重,腹水也增多。 2大鼠肺組織的病理學(xué)變化:肉眼和光鏡所見(jiàn)SO組肺組織結(jié)構(gòu)始終大致正常;AP組隨著時(shí)間的推移,肺組織水腫、充血、出血,肺萎陷與不張和炎細(xì)胞聚集面積逐漸擴(kuò)大,程度逐漸加重;而AP+ L-703,606組較AP組的組織結(jié)構(gòu)損傷相對(duì)較輕。 3血清淀粉酶的變化:在各時(shí)間點(diǎn),SO組無(wú)明顯變化,AP組及AP+ L-703,606組與SO組比較均明顯升高(P0.05)。 4血清脂肪酶的變化:在各時(shí)間點(diǎn),SO組無(wú)明顯變化,AP組及AP+ L-703,606組與SO組比較均明顯升高(P0.05)。AP+ L-703,606組與AP組比較,12h時(shí)間點(diǎn)的脂肪酶升高(P0.05)。 5肺組織濕/干重比率:在各時(shí)點(diǎn),SO組肺組織濕/干重比率在不同時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化,與SO組比較,AP組與AP+ L-703,606組在各時(shí)點(diǎn)均明顯升高(P0.05),與AP組比較,AP+ L-703,606組在各時(shí)間點(diǎn)肺組織濕/干重比率明顯降低(P0.05)。 6 MPO活力的變化:SO組MPO活力在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異,與SO組比較,AP組與AP+ L-703,606組MPO活力在各時(shí)點(diǎn)明顯增強(qiáng)(P0.05)。與AP組比較,AP+ L-706, 303,在各時(shí)間點(diǎn)MPO活力明顯降低(P0.05)。 7 P物質(zhì)在肺組織中的表達(dá):SO組肺組織有弱的P物質(zhì)表達(dá),AP組與AP+ L-703,606組,在血管內(nèi)皮細(xì)胞,肺泡上皮細(xì)胞,炎性細(xì)胞及肺間質(zhì)均有明顯增強(qiáng)的P物質(zhì)表達(dá),免疫組化評(píng)分顯示AP+L-703,606組表達(dá)強(qiáng)度低于AP組(P0.05)。 8 NK-1R在肺組織中的表達(dá):密度掃描分析示SO組肺組織有弱的NK-1R表達(dá),AP組與AP+ L-703,606組NK-1R表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.05),AP+ L-703,606組與AP組比較NK-1R表達(dá)無(wú)明顯改變。 結(jié)論: 1逆行膽胰管內(nèi)注射5%�；悄懰徕c,通過(guò)檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶升高,胰腺組織HE染色觀察到胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死,肺組織水腫、充血、出血、萎陷、不張與炎細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn),證實(shí)大鼠AP相關(guān)性肺損傷模型制備成功。 2在AP大鼠肺組織中,P物質(zhì)與其受體NK-1R的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組,表明P物質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在AP相關(guān)性肺損傷的發(fā)病機(jī)制中可能起作用。 3 L-703,606是強(qiáng)有力的NK-1R拮抗劑,能降低P物質(zhì)表達(dá),降低肺組織濕/干重比率與MPO活力,改善肺組織病理?yè)p傷,認(rèn)為L(zhǎng)-703,606對(duì)大鼠AP相關(guān)肺損傷起到有效的治療作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R576;R563.8

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 干曉瑜;通腑湯對(duì)急性肺損傷大鼠肺、腸組織SP的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2796167