【摘要】： 急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床上常見的急腹癥之一,特別是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis , SAP)并發(fā)癥多,預后兇險,病死率可高達30%～40%。急性肺損傷及其終末階段急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是AP最常見而嚴重的并發(fā)癥,為臨床SAP病人死亡的重要原因之一。 神經(jīng)激肽P物質是神經(jīng)源性炎癥反應中的重要介質,在免疫反應中亦起著重要作用。近年來,P物質在AP與其相關性肺損傷中的作用已被人們認識,并逐漸引起重視。已知P物質是一種舒血管物質,能增加血管通透性,導致血漿滲出與水腫。P物質能夠誘導白細胞黏附與浸潤,還能調節(jié)多種細胞因子的產(chǎn)生并與T細胞增殖,B淋巴細胞產(chǎn)生抗體及單核巨噬細胞與肥大細胞釋放炎性介質,多形核白細胞呼吸爆發(fā)等功能作用相關。P物質主要是通過與相應神經(jīng)激肽受體(neurokinin-1 receptors, NK-1R)結合,介導G蛋白偶聯(lián)的第二信號途徑而發(fā)揮作用的。研究發(fā)現(xiàn),在AP過程中,P物質釋放明顯增加,其相應NK-1R表達亦明顯增加。反映肺組織血漿、炎細胞滲出程度的肺濕/干重率明顯增加,作為反映中性粒細胞聚集程度指標的髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活力亦明顯增強。Lau等發(fā)現(xiàn)在雨蛙肽誘導的小鼠急性胰腺炎模型中通過腹腔給予P物質受體拮抗劑CP-96,345可以降低血清淀粉酶水平,減輕胰腺與肺組織的水腫、出血、炎細胞浸潤等病理損傷,降低MPO活性,降低微血管通透性,從而為AP相關性肺損傷的治療提供一新的途徑。 目的: 本研究通過建立大鼠AP模型,并施予P物質受體拮抗劑L-703,606干預,觀察肺組織的濕/干重比率,MPO活性,病理改變及P物質與NK-1R的表達情況,探討其在AP炎癥反應中的作用,探討L-703,606對實驗性AP的治療作用及機制。 方法: 1動物模型的制備:選取雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口進入腹腔,用4號加工鈍頭頭皮靜脈針頭于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管,以0.2 ml/min速度注入5%�；悄懰徕c(0.1 ml/100g),推藥后捏閉胰膽管入十二指腸處,觀察3 min,剪除除結扎線,關腹。 2實驗分組:將雄性Sprague-Dawley大鼠54只,隨機分為假手術組(SO組, n=18)、急性胰腺炎組(AP組, n=18)、急性胰腺炎治療組(AP+ L-703,606組, n=18),后又以不同時間點3 h、6 h、12 h分為三個亞組,每個亞組為6只大鼠。AP+ L-703,606組于不同時間點造模前15 min經(jīng)尾靜脈預防性注射L-703,606(250 nmol /kg)。 3肺組織濕/干重率測定:取左肺葉,以吸水紙吸干表面液體,稱取濕重,置于60°C烤箱烤72 h至恒重,稱取干重,計算濕/干重比率。 4生化指標測定:取血清樣本,采用全自動血清生化分析儀檢測血清淀粉酶、脂肪酶,由河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生化室協(xié)助測定。 5胰腺、肺組織學檢查:采用石蠟切片,HE染色。 6 MPO活力測定:取肺組織制成組織勻漿,用化學比色法測定,具體操作按南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書進行。 7免疫組織化學染色:脫蠟至水,抗原熱修復后,用3%過氧化氫孵育15 min。封閉一抗4°C過夜,陰性對照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15 min,后用3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色,復染后封片。以細胞漿內呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達。 8 western blot: 100 mg肺組織經(jīng)超聲細胞粉碎機徹底粉碎,加入1 ml細胞裂解液,充分裂解,提取NK-1R膜蛋白(具體操作按說明書),取20μg與上樣緩沖液充分混合,置于SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉移至NC膜,以5%的脫脂奶粉封閉,一抗(1:250) 4°C孵育過夜,以相應的二抗室溫下孵育2 h,抗體檢測按Santa Cruz公司試劑盒說明書進行。 結果: 1大鼠胰腺的病理學變化:肉眼和光鏡所見SO組胰腺及周圍組織結構始終大致正常;AP組和AP+L-703,606組隨著時間的推移,胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死面積逐漸擴大,程度逐漸加重,腹水也增多。 2大鼠肺組織的病理學變化:肉眼和光鏡所見SO組肺組織結構始終大致正常;AP組隨著時間的推移,肺組織水腫、充血、出血,肺萎陷與不張和炎細胞聚集面積逐漸擴大,程度逐漸加重;而AP+ L-703,606組較AP組的組織結構損傷相對較輕。 3血清淀粉酶的變化:在各時間點,SO組無明顯變化,AP組及AP+ L-703,606組與SO組比較均明顯升高(P0.05)。 4血清脂肪酶的變化:在各時間點,SO組無明顯變化,AP組及AP+ L-703,606組與SO組比較均明顯升高(P0.05)。AP+ L-703,606組與AP組比較,12h時間點的脂肪酶升高(P0.05)。 5肺組織濕/干重比率:在各時點,SO組肺組織濕/干重比率在不同時間點無明顯變化,與SO組比較,AP組與AP+ L-703,606組在各時點均明顯升高(P0.05),與AP組比較,AP+ L-703,606組在各時間點肺組織濕/干重比率明顯降低(P0.05)。 6 MPO活力的變化:SO組MPO活力在各時間點無明顯差異,與SO組比較,AP組與AP+ L-703,606組MPO活力在各時點明顯增強(P0.05)。與AP組比較,AP+ L-706, 303,在各時間點MPO活力明顯降低(P0.05)。 7 P物質在肺組織中的表達:SO組肺組織有弱的P物質表達,AP組與AP+ L-703,606組,在血管內皮細胞,肺泡上皮細胞,炎性細胞及肺間質均有明顯增強的P物質表達,免疫組化評分顯示AP+L-703,606組表達強度低于AP組(P0.05)。 8 NK-1R在肺組織中的表達:密度掃描分析示SO組肺組織有弱的NK-1R表達,AP組與AP+ L-703,606組NK-1R表達明顯增強(P0.05),AP+ L-703,606組與AP組比較NK-1R表達無明顯改變。 結論: 1逆行膽胰管內注射5%�；悄懰徕c,通過檢測血清淀粉酶、脂肪酶升高,胰腺組織HE染色觀察到胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死,肺組織水腫、充血、出血、萎陷、不張與炎細胞浸潤等表現(xiàn),證實大鼠AP相關性肺損傷模型制備成功。 2在AP大鼠肺組織中,P物質與其受體NK-1R的表達均明顯高于對照組,表明P物質介導的信號轉導途徑在AP相關性肺損傷的發(fā)病機制中可能起作用。 3 L-703,606是強有力的NK-1R拮抗劑,能降低P物質表達,降低肺組織濕/干重比率與MPO活力,改善肺組織病理損傷,認為L-703,606對大鼠AP相關肺損傷起到有效的治療作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R576;R563.8

【引證文獻】

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1 干曉瑜;通腑湯對急性肺損傷大鼠肺、腸組織SP的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學;2010年

本文編號：2796167