【摘要】：肝纖維化是各種慢性肝病導(dǎo)致肝硬化的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)之路,是對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)的大量產(chǎn)生特別是Ⅰ型膠原的異常沉積為主要特征。其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源,在正常肝臟組織中數(shù)目很少,為肝內(nèi)膠原合成的主要細(xì)胞,它在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。HSC的激活和增殖促進(jìn)肝纖維化,抑制HSC的增殖、誘導(dǎo)其凋亡可減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。所以近年來,抑制肝星狀細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)其凋亡已經(jīng)成為研究、治療肝纖維化的重點(diǎn)課題。而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活、增殖和凋亡機(jī)制非常復(fù)雜,涉及許多細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)蛋白、及各種信號通路,HSC的激活和增殖涉及的主要的細(xì)胞因子主要有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、胰島素生長因子(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)以及血小板源性生長因子又稱血小板衍化生長因子(PDGF)等,調(diào)節(jié)HSC凋亡的主要有Bcl-2家族、caspase家族等通過各種凋亡信號途徑引起細(xì)胞凋亡。PDGF是目前已知的最強(qiáng)的促HSC增殖因子,而活化的HSC分泌大量的PDGF,通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,下調(diào)p27的表達(dá)而促進(jìn)HSC進(jìn)入S期,使HSC持續(xù)活化和增殖,導(dǎo)致HSC明顯增殖。在肝纖維化的過程中,PDGF可通過系列信號傳導(dǎo)激活A(yù)kt/p70S6k信號通路,通過阻斷Akt/p70S6k信號通路可達(dá)到抑制HSC的增殖、促進(jìn)其凋亡并減少Ⅰ型膠原的表達(dá)的效果。 草蓯蓉為長白山區(qū)特有的天然要用植物,具有抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、抗炎等作用,先期研究已證實(shí),草蓯蓉乙醇提取物有抗肝纖維化的作用。樸虎林等通過研究已經(jīng)證明草蓯蓉乙醇提取物可較好的防治四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。2005年世界華人消化雜志發(fā)表樸熙緒等關(guān)于草蓯蓉乙醇提取物對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的治療作用的論文,通過采血及取肝組織檢測各項(xiàng)指標(biāo),結(jié)果草蓯蓉組與模型組相比肝纖維化的程度減輕,而且發(fā)現(xiàn)在肝組織中α平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)表達(dá)下降,實(shí)驗(yàn)表明草蓯蓉可能通過抑制肝星狀細(xì)胞的激活和抗脂質(zhì)過氧化物作用來防治大鼠肝纖維化的發(fā)生。吳春松等通過豬血清誘導(dǎo)大鼠發(fā)生肝纖維化制造模型,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉可以使PCⅡ、CⅣ的作用降低,并能抑制轉(zhuǎn)化生長因子及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。并且經(jīng)過病理組織學(xué)檢查,草蓯蓉能夠明顯改善模型中大鼠的肝臟纖維化。并且具有抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和膠原合成作用。 目的：本實(shí)驗(yàn)以大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)作為實(shí)驗(yàn)對象,研究草蓯蓉乙醇提取物對其生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了凋亡調(diào)節(jié)蛋白、Akt/p70S6k信號通路對HSC增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制及Ⅰ膠原表達(dá)的影響。為草蓯蓉成為防治肝纖維化的有效天然藥物提供有利依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)選用大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)作為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行體外培養(yǎng),用MTT比色法測定不同濃度、不同時(shí)間段草蓯蓉乙醇提取物對HSC-T6的抗增殖作用；應(yīng)用倒置顯微鏡、HE染色光學(xué)顯微鏡、吖啶橙/溴化乙錠雙染色熒光顯微鏡及掃描電鏡技術(shù)觀察藥物作用后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用流式細(xì)胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的變化。應(yīng)用RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原α1(I) mRNA的表達(dá),觀察膠原合成的變化。Western Blotting法檢測凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9; Akt/p70S6k信號通路中總的Akt和p70S6k及磷酸化的Akt和p70S6k；Ⅰ型膠原蛋白,用于觀察凋亡調(diào)節(jié)蛋白和信號通路對肝星狀細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。 結(jié)果：①M(fèi)TT實(shí)驗(yàn)表明：草蓯蓉乙醇提取物能有效抑制HSC-T6細(xì)胞增殖,并呈現(xiàn)出濃度以及時(shí)間的依賴性關(guān)系。②形態(tài)學(xué)變化：通過HE染色、AO/EB熒光染色、TUNEL染色、以及透射和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)草蓯蓉乙醇提取物作用于HSC-T6細(xì)胞后出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞表面的微絨毛消失,體積變小,胞質(zhì)濃縮,核染色質(zhì)邊集、細(xì)胞核固縮、并出現(xiàn)核碎裂、出泡等現(xiàn)象。③流式細(xì)胞儀檢測：經(jīng)草蓯蓉乙醇提取物處理后大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期,并且與對照組相比凋亡率明顯上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,凋亡率隨藥物濃度的升高而呈增高趨勢。④Western Blotting法測定Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表明：草蓯蓉乙醇提取物顯著上調(diào)促凋亡蛋白,Bax明顯增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2則顯著降低,且兩者都表現(xiàn)劑量依賴性,導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值上升。草蓯蓉還明顯增加活化的caspase-3和活化的caspase-9蛋白水平。⑤Western Blotting法檢測測定Akt和p70S6表明：草蓯蓉乙醇提取物明顯能抑制磷酸化的Akt和p70S6k水平,而總的Akt和p70S6k水平無改變,表明Akt/p70S6k信號通路受到抑制。⑥Real-timePCR和Western Blotting法測定Ⅰ膠原表達(dá)顯示：草蓯蓉乙醇提取物能顯著抑制Ⅰ型膠原α1(Ⅰ)mRNA的表達(dá)和下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：①草蓯蓉乙醇提取物在體外可明顯抑制HSC-T6的增殖。②草蓯蓉乙醇提取物在體外可誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)凋亡,并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。③草蓯蓉乙醇提取物顯著上調(diào)活化的caspase-3和caspase-9;下調(diào)Bcl-2/Bax比率。④草蓯蓉乙醇提取物明顯抑制PDGF激活的Akt/p70S6k信號通路。⑤草蓯蓉乙醇提取物能顯著抑制Ⅰ型膠原α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R285.5;R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2795755