【摘要】：目的：觀察脂氧素A4(LXA4)對體外大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,觀察LXA4對急性肝衰竭大鼠的保護(hù)作用,并初步探求及作用機(jī)制。 方法： 1.原位灌流法分離大鼠Kupffer細(xì)胞(KCs),采用臺盼藍(lán)拒染法測KCs活性,吞噬實驗檢測KCs功能。采用ED1免疫細(xì)胞熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒別KCs純度。 2.脂多糖(LPS)刺激KCs 12小時、24小時、36小時,分別檢測上清中TNF-α的含量,將LXA4與KCs共孵育半小時,后給予LPS,檢測細(xì)胞上清中TNF-α的含量。 3.將肝細(xì)胞與KCs共培養(yǎng),給予D-氨基半乳糖(D-GaIN)/LPS刺激24小時后檢測上清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量,收集肝細(xì)胞,Annexin V-FITC法檢測細(xì)胞凋亡。在給予D-GalN/LPS刺激前半小時先加入LXA4預(yù)孵育,再加入D-GalN/LPS刺激,檢測細(xì)胞上清ALT及AST水平,檢測肝細(xì)胞凋亡。 4.采用D-GalN+LPS腹腔注射建立大鼠急性肝衰竭動物模型。實驗分為六組：正常組、模型組、LXA4小、中、大劑量組、四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)組。肝組織病理切片觀察肝組織損傷情況;自動生化儀檢測肝功能；ELISA法檢測血清TNF-α及IL-6水平, Caspase 3活性檢測試劑盒檢測肝組織Caspase3酶活性；Realtime-PCR檢測TNF-a mRNA及IL-6 mRNA表達(dá);原位末端標(biāo)記法(TUNEL)法檢測肝細(xì)胞凋亡率；分離大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞,提取核蛋白,凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)檢測肝細(xì)胞及kupffer細(xì)胞核蛋白NF-κB活性。 結(jié)果： 1.KCs活性測定：活細(xì)胞數(shù)量在90-96%之間,平均(92.3±2.12)%。每只大鼠分離的KCs總量平均為(2.41±0.32)×107 2.KCs吞噬實驗顯示有功能的細(xì)胞數(shù)(95.2±2.58)%。 3.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞純度在(96.3±1.46)% 4.LPS刺激Kupffer細(xì)胞后,上清中TNF-α含量在12小時明顯升高,24小時達(dá)到峰值。用LXA4預(yù)孵育組TNF-α含量明顯減少(P0.05)。 5.肝細(xì)胞與KCs共培養(yǎng)后給予D-GalN/LPS刺激24小時,檢測上清液轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高,肝細(xì)胞凋亡率增加,與LXA4預(yù)孵育組比較,P0.05。 6.大鼠急性肝衰竭時,肝組織炎癥壞死明顯,肝臟轉(zhuǎn)氨酶明顯升高,血清IL-6及TNF-a水平顯著升高,肝組織TNF-a mRNA及IL-6 mRNA表達(dá)明顯升高,Caspase3活性明顯增強(qiáng)；肝組織TUNEL檢測細(xì)胞凋亡明顯增加,kupffer細(xì)胞及肝細(xì)胞核蛋白NF-κB活性明顯增強(qiáng)；脂氧素組及PDTC組組織學(xué)改變均明顯好轉(zhuǎn),肝臟轉(zhuǎn)氨酶、細(xì)胞因子及NF-κB活性明顯下降(與模型組比較,P0.05,),且脂氧素與療效存在劑量依存關(guān)系；脂氧素大劑量組組及PDTC組比較,上述大部分指標(biāo)之間P0.05。 結(jié)論： 1.成功分離了大鼠KCs,在數(shù)量活性純度方面均達(dá)到實驗要求。 2.在體外實驗中,LXA4能夠抑制KCs細(xì)胞分泌TNF-α,能夠減少肝細(xì)胞凋亡和壞死。 3.體內(nèi)實驗證實LXA4對急性肝衰竭大鼠具有保護(hù)作用。能夠提高存活率,明顯改善肝臟組織學(xué)和生化學(xué)指標(biāo),減少致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量,抑制肝細(xì)胞凋亡,其護(hù)肝作用具有量效關(guān)系。 4.LXA4對大鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用部分是通過阻斷kupffer細(xì)胞NF-κB活化,減少致炎性細(xì)胞因子的分泌來實現(xiàn)的。同時,LXA4能夠阻斷肝細(xì)胞的凋亡途徑。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 王偉林;鄭樹森;徐驍;梁廷波;金晶;沈巖;張珉;吳健;;急診肝移植治療良性終末期肝病的臨床分析[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年49期

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本文編號：2794395