發(fā)布時(shí)間：2020-08-12 21:30

【摘要】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起急、慢性肝炎的重要肝嗜性病毒之一。然而,目前對(duì)HCV感染慢性化和免疫逃逸的致病機(jī)理仍然缺乏全面深入的理解。要建立持續(xù)性感染,病毒必須調(diào)控參與細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、生物大分子合成和代謝的關(guān)鍵信號(hào)通路。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號(hào)通路即為這樣的信號(hào)通路。已發(fā)現(xiàn)多種DNA病毒調(diào)控mTOR通路以促進(jìn)持續(xù)性感染和致病。同時(shí),凋亡作為維持細(xì)胞穩(wěn)定性的重要生理機(jī)制,其功能失調(diào)常常見(jiàn)于持續(xù)性病毒感染。我們前期發(fā)表的結(jié)果表明HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5A (nonstructural protein 5A, NS5A)結(jié)合細(xì)胞蛋白FKBP38從而抑制細(xì)胞凋亡,但其機(jī)理不詳。近期發(fā)現(xiàn)FKBP38為mTOR通路新成員,在營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子控制下,FKBP38結(jié)合并抑制mTOR激酶活性。為了進(jìn)一步理解NS5A的生物學(xué)活性以及HCV持續(xù)性感染的致病機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)研究了HCV NS5A對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及其對(duì)細(xì)胞存活的影響。 在人肝癌細(xì)胞系Huh7中過(guò)表達(dá)HCV NS5A的結(jié)果表明,血清饑餓條件下NS5A以時(shí)間和劑量依賴方式增加mTOR下游靶點(diǎn)S6K1和4EBP1磷酸化水平。而在10%血清存在條件下,NS5A不能提高S6K1和4EBP1磷酸化水平。同樣,在血清饑餓條件下,NS5A穩(wěn)定表達(dá)的Huh7細(xì)胞(NS5A-Huh7)和HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中,S6K1和4EBP1磷酸化水平明顯高于對(duì)照細(xì)胞(neo-Huh7)。mTOR特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin)或NS5A特異性的siRNA (siNS5A)可阻斷NS5A對(duì)S6K1和4EBP1的磷酸化作用,提示NS5A特異性的活化mTOR信號(hào)通路。但是,在NS5A-Huh7細(xì)胞中,PI3K特異性抑制劑LY294002不能阻斷NS5A對(duì)S6K1和4EBP1的磷酸化作用,表明NS5A活化mTOR通路不依賴于其上游組分PI3K。進(jìn)一步運(yùn)用NS5A突變體(NS5A-AI,不與FKBP38結(jié)合)、FKBP38突變體(FKBP38-Δ3×TPR,不與NS5A結(jié)合)以及FKBP38特異性siRNA (siFKBP38)研究發(fā)現(xiàn),NS5A對(duì)mTOR通路的活化作用依賴于NS5A與FKBP38的結(jié)合。 為了探索NS5A活化mTOR信號(hào)通路的機(jī)制,我們考察了NS5A、FKBP38、mTOR三者的結(jié)合情況。在過(guò)表達(dá)NS5A的Hela和Huh7細(xì)胞中,運(yùn)用GST-pull down方法證明,在血清饑餓條件下,GST-FKBP38與mTOR的結(jié)合消失,而GST-FKBP38仍與NS5A結(jié)合。這些結(jié)果在NS5A-Huh7和HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中得到了一致的驗(yàn)證。更重要的是,在NS5A-Huh7和HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中,GST-FKBP38-Δ3×TPR可回復(fù)性結(jié)合mTOR。這些結(jié)果提示NS5A可破壞FKBP38與：mTOR的結(jié)合。與GST-pull down結(jié)果相同,在同時(shí)過(guò)表達(dá)FKBP38與NS5A的Huh7細(xì)胞中,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明,血清饑餓條件下FKBP38與mTOR的結(jié)合消失,FKBP38仍與NS5A結(jié)合。同時(shí),有無(wú)血清并不影響NS5A-FKBP38的結(jié)合。單獨(dú)過(guò)表達(dá)FKBP38且無(wú)血清存在時(shí),FKBP38與mTOR結(jié)合,而有血清存在時(shí)兩者結(jié)合消失。NS5A與mTOR之間不存在直接或間接結(jié)合。這些結(jié)果在neo-Huh7、NS5A-Huh7及HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。另外,同時(shí)過(guò)表達(dá)NS5A-ΔI和FKBP38、或NS5A和FKBP38-Δ3×TPR時(shí),可恢復(fù)mTOR與FKBP38的結(jié)合。共定位分析發(fā)現(xiàn),血清饑餓條件下,NS5A-Huh7、HCV Replicon細(xì)胞中FKBP38與mTOR的共定位消失。這些結(jié)果提示NS5A是通過(guò)與mTOR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后者內(nèi)源性抑制劑FKBP38,從而活化mTOR信號(hào)通路。 以往研究表明mTOR信號(hào)通路活化可促進(jìn)細(xì)胞存活。因此,我們進(jìn)一步在無(wú)血清存在條件下利用凋亡誘導(dǎo)劑星孢菌素(stauroporine)考察了NS5A活化mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無(wú)rapamycin預(yù)處理的NS5A-Huh7中,caspase3和PARP活化水平明顯低于rapamycin預(yù)處理的NS5A-Huh7細(xì)胞、rapamycin處理或不處理的對(duì)照neo-Huh7細(xì)胞。Hoechst33342染色結(jié)果也表明,rapamycin未處理的NS5A-Huh7凋亡數(shù)量明顯低于rapamycin處理的NS5A-Huh7細(xì)胞、以及rapamycin處理或不處理的對(duì)照neo-Huh7細(xì)胞。而且,NS5A特異性siRNA可明顯恢復(fù)NS5A-Huh7細(xì)胞對(duì)staurosporine誘導(dǎo)凋亡的敏感性,表現(xiàn)為caspase3和PARP活化水平明顯升高。這些結(jié)果提示NS5A通過(guò)mTOR信號(hào)通路特異性抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,同時(shí)過(guò)表達(dá)NS5A和FKBP38且無(wú)rapamycin預(yù)處理的Huh7細(xì)胞中,caspase3、PARP活化水平低于同時(shí)過(guò)表達(dá)NS5A和FKBP38-Δ3×TPR、或NS5A-ΔI和FKBP38且rapamycin預(yù)處理或不預(yù)處理的Huh7細(xì)胞。與此一致,用FKBP38特異性siRNA (siFKBP38)單獨(dú)處理NS5A-Huh7、HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞發(fā)現(xiàn),其caspase3、PARP活化水平明顯低于rapamycin聯(lián)合siFKBP38處理或rapamycin單獨(dú)處理的細(xì)胞。Hoechst33342染色也得到一致的結(jié)果。這些結(jié)果提示,NS5A通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡依賴于NS5A-FKBP38結(jié)合。 上述結(jié)果表明,HCV NS5A通過(guò)與mTOR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后者內(nèi)源性抑制劑FKBP38,活化mTOR信號(hào)通路,從而抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活。提示HCV編碼的病毒蛋白可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞關(guān)鍵信號(hào)通路,從而促進(jìn)HCV持續(xù)性感染、參與HCV致病機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

士學(xué)位論文丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白SA對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及其功能研不轉(zhuǎn)染(mock)，以不含血清(0%FBs)或含血清(10%FBS)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收胞，Westernbolt檢測(cè)磷酸化s6KI(ps6KI，T389)、磷酸化4EBpl(p4EBpl，T37/46)、S6K白、4EBP一總蛋白、mye標(biāo)簽蛋白(mye一s5A)和p一aetin。各種一抗除p一actin抗體以l:5用外，其他抗體均以1:1000稀釋使用，以下實(shí)驗(yàn)同此。2NSS^以時(shí)間和劑t依賴方式活化mTOR信號(hào)通路為了進(jìn)一步確認(rèn)Ns5A對(duì)mTOR通路的活化作用，轉(zhuǎn)染NSSA的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間胞后，(12、24、48、72h)或以不同劑量NSSA質(zhì)粒(0.2、0.4分析發(fā)現(xiàn)，NSSA以時(shí)間和劑量依賴方式增加S6KI、、0.6、0.8林g)轉(zhuǎn)染H4EBpl磷酸化水平，在72h或0.8林g劑量時(shí)達(dá)到高峰(圖1.2A、B)。

士學(xué)位論文丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白SA對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及其功能為了考察NSSA在生理?xiàng)l件下是否活化mTOR通路，我們比較了NSSA穩(wěn)定(Ns5A一Huh7)、Hcv亞基因組復(fù)制子細(xì)胞(HCvRePlicon)與空載體穩(wěn)定細(xì)(neo一Huh7)中s6KI、4EBpl的磷酸化情況。結(jié)果表明，NSSA一Huh7和HevRep胞中S6KI、4EBPI磷酸化水平大大高于neo.Huh7細(xì)胞(圖1.3A)。同時(shí)，利用mTOR特異性激酶抑制劑雷帕霉素(raPamycin)處理細(xì)胞，或特iRNA(:iNs5A)干擾Ns5A表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Ns5A一Huh7和HCvReplieon細(xì)胞aPamyein可明顯抑制S6KI、4EBpl磷酸化(圖1.3A、B)。siNSSA干擾NSSA一HNSSA表達(dá)后，其S6KI、4EBPI磷酸化水平明顯下降，而對(duì)照siRNA(siGFP此效應(yīng)(圖l.3B)。在neo一Huh7細(xì)胞中，無(wú)論是siNSSA、還是siGFP，對(duì)S6KI、4E酸化均無(wú)影響(圖1.3B)。這些結(jié)果提示，在HCV感染的生理?xiàng)l件下，Ns5A特化mTOR信號(hào)通路。AB

圖 5Ns5A對(duì)價(jià)oR與「K即38共定位的影響月.noe一Huh7、NSSA一Huh7、HCVReplieon接種l‘12孔培養(yǎng)板。過(guò)夜培養(yǎng)貼壁后，以含10%血清(+)或O%血清(一)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。‘}長(zhǎng)J幾浴、玻)}‘}二的細(xì)胞經(jīng)活}定不}}封閉后，與anti一FKBp38抗體(小鼠)、anti一mTOR打乙體(兔)孵育。然后，細(xì)胞‘。AlexaFI盯。488交聯(lián)的打L小鼠一抗(綠色)、C鄧交聯(lián)的抗兔飛抗(紅色)孵育。處理完畢的細(xì)胞在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察結(jié)果。B來(lái)自(月)的細(xì)胞裂解物用丁‘ Westernblotting分析NSSA、FKBp38、InTOR及p一aetin的表達(dá)。NSSA活化mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞存活的影響NSSA通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制Caspase3和PARP活化mTOR信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞歌要生理過(guò)程，如細(xì)胞存活、增生和代謝[35}。近期報(bào)

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2791050