發(fā)布時間：2020-08-11 20:30

【摘要】：背景潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是由多因素引起的以免疫紊亂和炎癥細(xì)胞活化為明顯特征的炎癥性腸疾病,其中巨噬細(xì)胞的活化在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。NLRP3炎癥小體的激活是巨噬細(xì)胞活化的主要形式之一,同時也是IL-1β炎癥因子生成的主要來源。在長期的炎癥條件下,結(jié)腸上皮細(xì)胞受損,細(xì)胞凋亡率明顯上升,進(jìn)一步加重疾病的進(jìn)展。因此針對該病,抑制炎癥反應(yīng)和減輕結(jié)腸上皮的損傷是疾病治療的主要策略。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族II型跨膜蛋白,又稱Apo2L,與其受體DR5(TRAIL-R2)結(jié)合以后除了可以引發(fā)腫瘤細(xì)胞的程序化死亡外,在某些條件下也可以誘導(dǎo)正常細(xì)胞的死亡。而且,DR5與TRAIL結(jié)合以后可以激活NF-κB、MAPK等通路,誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生比如IL-1β、TNFα等,這暗示了TRAIL-DR5通路可能通過NLRP3炎癥小體調(diào)控巨噬細(xì)胞活化,參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。在本研究中我們探討了TRAIL是否通過NLRP3炎癥小體調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化,參與炎癥。同時,我們利用sDR5-Fc融合蛋白阻斷TRAIL-DR5通路觀察其對小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎是否具有改善作用。目的研究sDR5-Fc對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用及機制。方法用3%的DSS建立小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,動物被隨機分為六組,分別為Normal、DSS、hIgG、益賽普、sDR5-Fc 10 mg/kg、sDR5-Fc 20 mg/kg。每兩天給一次藥,每天給小鼠進(jìn)行疾病活動性評分(disease activity index,DAI),主要包括體重下降、腹瀉、出血三個方面。小鼠在建模的第六天處死,取全血,離心取上清,用于ELISA檢測血清IL-1β的含量;取腸系膜淋巴結(jié),流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞的改變;取整段結(jié)腸記錄長度,并取遠(yuǎn)端一式三份,一份用于Western blot檢測NLRP3炎癥小體、各相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平;另一份結(jié)腸組織用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測NLRP3炎癥小體和各相關(guān)炎癥因子基因水平的改變;最后一份放4%多聚甲醛中固定,IHC檢測結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞的變化,并連續(xù)切片對巨噬細(xì)胞和NLRP3進(jìn)行了共定位,HE驗證結(jié)腸組織病理改變和sDR5-Fc對小鼠心肝脾肺腎的安全性初步評價。在NCM460細(xì)胞中,我們利用不同濃度的LPS(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)單獨刺激或100ng/mL LPS與不同濃度的TRAIL(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL)共同刺激NCM460細(xì)胞,使用caspase3/7活性檢測試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞受損凋亡情況;收取細(xì)胞蛋白,利用蛋白免疫印跡實驗Western blot檢測DR5、Bax和Bak的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS的釋放。用100 ng/mL LPS單獨刺激或100 ng/mL LPS與不同濃度的TRAIL(50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)、sDR5-Fc(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)共同刺激THP-1細(xì)胞,使用Western blot檢測NLRP3、pro-caspase1、caspase1-p20、p-p65、DR5的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1)體內(nèi)實驗表明急性潰瘍性結(jié)腸炎模型組小鼠體重明顯下降、DAI評分明顯增加、結(jié)腸長度明顯縮短;此外,結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞,炎細(xì)胞浸潤增多,腸隱窩數(shù)量明顯減少,而sDR5-Fc治療組小鼠以上癥狀明顯改善。同時,sDR5-Fc可以減少結(jié)腸組織巨噬細(xì)胞的浸潤,上調(diào)腸系膜淋巴結(jié)中M2型巨噬細(xì)胞,下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞。免疫組化對NLRP3和巨噬細(xì)胞定位的結(jié)果表明組織中浸潤的巨噬細(xì)胞是表達(dá)NLRP3的主要細(xì)胞,而sDR5-Fc組小鼠結(jié)腸組織的NLRP3、Caspase1、IL-1β的基因和蛋白水平與IgG組相比明顯下降。除此之外,RT-PCR的結(jié)果顯示sDR5-Fc治療組小鼠的MCP-1趨化因子和TNFα炎癥因子的基因水平明顯比IgG組降低。(2)體外結(jié)果顯示SDR5-Fc可以抑制TRAIL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化;另外,sDR5-Fc能夠抑制TRAIL誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡。(3)HE驗證sDR5-Fc的安全性顯示小鼠的心肝脾肺腎的組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常組無差異。結(jié)論sDR5-Fc通過與TRAIL結(jié)合抑制了結(jié)腸上皮細(xì)胞的損傷和巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化及炎性因子的分泌,從而改善了小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的疾病進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62
【圖文】：

結(jié)果結(jié) 果1. sDR5-Fc 能夠改善 UC 的疾病進(jìn)展我們用 DSS 誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎在建模過程中評價標(biāo)準(zhǔn)主要有體重下降程度和疾病活動性指數(shù)[26]，所以我們在建模期間每天記錄小鼠體重和進(jìn)行DAI 評分。結(jié)果顯示建立模型后 DSS 組和 hIgG 組小鼠與 Normal 組相比體重下降，DAI 評分顯著升高，而 sDR5-Fc 組治療后體重明顯增加（圖 1-1A），DAI 評分明顯下降（圖 1-1B），這說明 sDR5-Fc 可以減輕 UC 疾病癥狀。

圖 1-2 sDR5-Fc 改善 UC 疾病的病理損傷。A 圖為小鼠處死以后取各組結(jié)腸拍照結(jié)果；B 圖為結(jié)腸長度統(tǒng)計結(jié)果；C 圖為組織結(jié)構(gòu)病理改變；D 為組織損傷病理評分。2. sDR5-Fc 能夠減輕 UC 炎癥的發(fā)展2.1 sDR5-Fc 能夠減少 UC 小鼠巨噬細(xì)胞的浸潤在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中，巨噬細(xì)胞扮演了很重要的角色。巨噬細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下會分泌促炎因子導(dǎo)致組織損傷[5,27]，所以我們檢測了結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞的浸潤和小鼠腸系膜淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞分型。結(jié)果顯示 DSS 模型組和 hIgG 組小鼠結(jié)腸組織里巨噬細(xì)胞明顯增多（圖 2-1A），腸系膜淋巴結(jié)中 M1 型巨噬細(xì)胞明顯增加，M2 型巨噬細(xì)胞下降（圖 2-1B、2-1C）；而 sDR5-Fc 組的小鼠與 DSS 和 hIgG 組相比，結(jié)腸組織浸潤的巨噬細(xì)胞明顯下降，腸系膜淋巴結(jié)中 M2 型巨噬細(xì)胞明顯增高。這表明 sDR5-Fc 可以降低 UC 小鼠結(jié)腸組織巨噬細(xì)胞的浸潤，且能影響腸系膜淋巴結(jié)中巨噬細(xì)胞的分型。10×

圖 2-1 sDR5-Fc 能夠減少 UC 巨噬細(xì)胞的浸潤。A 圖為各組結(jié)腸組織里 F4/80 標(biāo)記的巨噬細(xì)胞結(jié)果；B 圖為各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞分型的檢測結(jié)果；C 圖為統(tǒng)計結(jié)果。2.2 sDR5-Fc 能夠抑制 NLRP3 炎癥小體的活化NLRP3 炎癥小體在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展也起到了很重要的作用[11,28]，炎癥疾 NLRP3 炎癥小體的活化越來越多的受到重視。既然 sDR5-Fc 能夠降低巨噬細(xì)胞的，那么它是否會影響與巨噬細(xì)胞有關(guān)的 NLRP3 炎癥小體的活化呢？首先我們LRP3 和巨噬細(xì)胞（F4/80 標(biāo)記）進(jìn)行了連續(xù)切片免疫組化共定位，結(jié)果表明浸潤的

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本文編號：2789531