【摘要】：背景潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是由多因素引起的以免疫紊亂和炎癥細胞活化為明顯特征的炎癥性腸疾病,其中巨噬細胞的活化在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。NLRP3炎癥小體的激活是巨噬細胞活化的主要形式之一,同時也是IL-1β炎癥因子生成的主要來源。在長期的炎癥條件下,結腸上皮細胞受損,細胞凋亡率明顯上升,進一步加重疾病的進展。因此針對該病,抑制炎癥反應和減輕結腸上皮的損傷是疾病治療的主要策略。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族II型跨膜蛋白,又稱Apo2L,與其受體DR5(TRAIL-R2)結合以后除了可以引發(fā)腫瘤細胞的程序化死亡外,在某些條件下也可以誘導正常細胞的死亡。而且,DR5與TRAIL結合以后可以激活NF-κB、MAPK等通路,誘導炎癥因子產生比如IL-1β、TNFα等,這暗示了TRAIL-DR5通路可能通過NLRP3炎癥小體調控巨噬細胞活化,參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。在本研究中我們探討了TRAIL是否通過NLRP3炎癥小體調控巨噬細胞的活化,參與炎癥。同時,我們利用sDR5-Fc融合蛋白阻斷TRAIL-DR5通路觀察其對小鼠急性潰瘍性結腸炎是否具有改善作用。目的研究sDR5-Fc對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用及機制。方法用3%的DSS建立小鼠急性潰瘍性結腸炎模型,動物被隨機分為六組,分別為Normal、DSS、hIgG、益賽普、sDR5-Fc 10 mg/kg、sDR5-Fc 20 mg/kg。每兩天給一次藥,每天給小鼠進行疾病活動性評分(disease activity index,DAI),主要包括體重下降、腹瀉、出血三個方面。小鼠在建模的第六天處死,取全血,離心取上清,用于ELISA檢測血清IL-1β的含量;取腸系膜淋巴結,流式細胞術檢測巨噬細胞的改變;取整段結腸記錄長度,并取遠端一式三份,一份用于Western blot檢測NLRP3炎癥小體、各相關炎癥因子的表達水平;另一份結腸組織用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應RT-PCR檢測NLRP3炎癥小體和各相關炎癥因子基因水平的改變;最后一份放4%多聚甲醛中固定,IHC檢測結腸組織中巨噬細胞的變化,并連續(xù)切片對巨噬細胞和NLRP3進行了共定位,HE驗證結腸組織病理改變和sDR5-Fc對小鼠心肝脾肺腎的安全性初步評價。在NCM460細胞中,我們利用不同濃度的LPS(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)單獨刺激或100ng/mL LPS與不同濃度的TRAIL(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL)共同刺激NCM460細胞,使用caspase3/7活性檢測試劑盒和流式細胞術檢測細胞受損凋亡情況;收取細胞蛋白,利用蛋白免疫印跡實驗Western blot檢測DR5、Bax和Bak的表達;流式細胞術檢測細胞ROS的釋放。用100 ng/mL LPS單獨刺激或100 ng/mL LPS與不同濃度的TRAIL(50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)、sDR5-Fc(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)共同刺激THP-1細胞,使用Western blot檢測NLRP3、pro-caspase1、caspase1-p20、p-p65、DR5的蛋白表達水平。結果(1)體內實驗表明急性潰瘍性結腸炎模型組小鼠體重明顯下降、DAI評分明顯增加、結腸長度明顯縮短;此外,結腸組織結構破壞,炎細胞浸潤增多,腸隱窩數(shù)量明顯減少,而sDR5-Fc治療組小鼠以上癥狀明顯改善。同時,sDR5-Fc可以減少結腸組織巨噬細胞的浸潤,上調腸系膜淋巴結中M2型巨噬細胞,下調M1型巨噬細胞。免疫組化對NLRP3和巨噬細胞定位的結果表明組織中浸潤的巨噬細胞是表達NLRP3的主要細胞,而sDR5-Fc組小鼠結腸組織的NLRP3、Caspase1、IL-1β的基因和蛋白水平與IgG組相比明顯下降。除此之外,RT-PCR的結果顯示sDR5-Fc治療組小鼠的MCP-1趨化因子和TNFα炎癥因子的基因水平明顯比IgG組降低。(2)體外結果顯示SDR5-Fc可以抑制TRAIL誘導的THP-1細胞NLRP3炎癥小體的活化;另外,sDR5-Fc能夠抑制TRAIL誘導的NCM460細胞凋亡。(3)HE驗證sDR5-Fc的安全性顯示小鼠的心肝脾肺腎的組織學結構與正常組無差異。結論sDR5-Fc通過與TRAIL結合抑制了結腸上皮細胞的損傷和巨噬細胞NLRP3炎癥小體的活化及炎性因子的分泌,從而改善了小鼠急性潰瘍性結腸炎的疾病進展。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62
【圖文】：

結果結 果1. sDR5-Fc 能夠改善 UC 的疾病進展我們用 DSS 誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎，潰瘍性結腸炎在建模過程中評價標準主要有體重下降程度和疾病活動性指數(shù)[26]，所以我們在建模期間每天記錄小鼠體重和進行DAI 評分。結果顯示建立模型后 DSS 組和 hIgG 組小鼠與 Normal 組相比體重下降，DAI 評分顯著升高，而 sDR5-Fc 組治療后體重明顯增加（圖 1-1A），DAI 評分明顯下降（圖 1-1B），這說明 sDR5-Fc 可以減輕 UC 疾病癥狀。

圖 1-2 sDR5-Fc 改善 UC 疾病的病理損傷。A 圖為小鼠處死以后取各組結腸拍照結果；B 圖為結腸長度統(tǒng)計結果；C 圖為組織結構病理改變；D 為組織損傷病理評分。2. sDR5-Fc 能夠減輕 UC 炎癥的發(fā)展2.1 sDR5-Fc 能夠減少 UC 小鼠巨噬細胞的浸潤在潰瘍性結腸炎的發(fā)生發(fā)展中，巨噬細胞扮演了很重要的角色。巨噬細胞在炎癥狀態(tài)下會分泌促炎因子導致組織損傷[5,27]，所以我們檢測了結腸組織中巨噬細胞的浸潤和小鼠腸系膜淋巴結的巨噬細胞分型。結果顯示 DSS 模型組和 hIgG 組小鼠結腸組織里巨噬細胞明顯增多（圖 2-1A），腸系膜淋巴結中 M1 型巨噬細胞明顯增加，M2 型巨噬細胞下降（圖 2-1B、2-1C）；而 sDR5-Fc 組的小鼠與 DSS 和 hIgG 組相比，結腸組織浸潤的巨噬細胞明顯下降，腸系膜淋巴結中 M2 型巨噬細胞明顯增高。這表明 sDR5-Fc 可以降低 UC 小鼠結腸組織巨噬細胞的浸潤，且能影響腸系膜淋巴結中巨噬細胞的分型。10×

圖 2-1 sDR5-Fc 能夠減少 UC 巨噬細胞的浸潤。A 圖為各組結腸組織里 F4/80 標記的巨噬細胞結果；B 圖為各組小鼠腸系膜淋巴結巨噬細胞分型的檢測結果；C 圖為統(tǒng)計結果。2.2 sDR5-Fc 能夠抑制 NLRP3 炎癥小體的活化NLRP3 炎癥小體在潰瘍性結腸炎的發(fā)生發(fā)展也起到了很重要的作用[11,28]，炎癥疾 NLRP3 炎癥小體的活化越來越多的受到重視。既然 sDR5-Fc 能夠降低巨噬細胞的，那么它是否會影響與巨噬細胞有關的 NLRP3 炎癥小體的活化呢？首先我們LRP3 和巨噬細胞（F4/80 標記）進行了連續(xù)切片免疫組化共定位，結果表明浸潤的

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