【摘要】：MicroRNA(MiRNA)是一類19-25nt的單鏈非編碼微小RNA,廣泛存在于從病毒、線蟲到動(dòng)植物的細(xì)胞中,在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯或裂解靶基因mRNA來負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。已證實(shí)miRNA參與了包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等多種調(diào)節(jié)途徑。 研究發(fā)現(xiàn),除動(dòng)植物細(xì)胞能編碼miRNA外,許多病毒也編碼了-niRNA。MiRNA注冊(cè)數(shù)據(jù)庫miRBase第19版已經(jīng)收錄了病毒來源的436個(gè)miRNAs分子,但這些病毒來源的miRNA絕大多數(shù)是DNA病毒所編碼,RNA病毒來源的miRNA屈指可數(shù)。目前,僅在逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒中的人免疫缺陷病毒(HIV)、牛白血病病毒(BLV)和非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒中的西尼羅河病毒(WNV)三種RNA病毒中發(fā)現(xiàn)病毒來源的miRNA,其他RNA病毒,特別是細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的RNA病毒編碼的miRNA至今未見報(bào)道。甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)類屬小核糖核酸病毒科肝病毒屬,是一種典型的細(xì)胞質(zhì)復(fù)制RNA病毒,其基因組為單股正鏈RNA。HAV在體外細(xì)胞培養(yǎng)中生長緩慢、復(fù)制周期長、復(fù)制效率低、不引起細(xì)胞病變,并形成持續(xù)性感染。這些獨(dú)特的特征提示,該類病毒極有可能像西尼羅河病毒一樣編碼功能性的miRNA來調(diào)控病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和增殖。 本研究以細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的單股正鏈RNA病毒甲型肝炎病毒(HAV)H2毒株為研究對(duì)象,分析其編碼miRNA的可能性,并對(duì)其編碼的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)和鑒定,同時(shí)探索其編碼miRNA的生物學(xué)途徑和所編碼miRNA的潛在生物學(xué)功能。 首先,我們利用VMir軟件和RNAstructure5.3軟件在HAV基因組RNA中發(fā)現(xiàn)4個(gè)潛在的pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu),分別為MD59、MD62、MD80和MD92,在負(fù)鏈RNA中發(fā)現(xiàn)有3個(gè)潛在的pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu),分別為MR37、MR49和MR62。利用同源片段搜索法預(yù)測(cè)pre-miRNA剪切后產(chǎn)生的成熟miRNA,結(jié)果顯示,這7個(gè)pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切后可能產(chǎn)生28種成熟的miRNAs序列。 其次,我們對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miRNAs分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和生物學(xué)特征鑒定。首先通過stem-loop RT-PCR法證實(shí)了9個(gè)預(yù)測(cè)的成熟miRNAs在HAV感染的KMB17細(xì)胞中表達(dá),我們將其作為候選miRNA并分別命名為：hav-miR-N1-5p、 hav-miR-N1-3p、hav-miR-D1-5p、hav-miR-D2-5p、hav-miR-N2-3p、hav-miR-D3a、 hav-miR-D3b、hav-miR-D4-3p、hav-miR-D4-5p。同時(shí)對(duì)這9個(gè)候選niRNAs進(jìn)行基于RT-PCR的miRNA cDNA克隆及測(cè)序分析,結(jié)果顯示,9個(gè)候選miRNAs被擴(kuò)增序列與預(yù)測(cè)的序列完全一致,進(jìn)一步證明了這9個(gè)候選miRNAs在HAV感染的細(xì)胞中的確被表達(dá)。在獲得HAV來源的9個(gè)miRNAs序列后,我們對(duì)它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了poly (A)-tailed RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示9個(gè)miRNAs都能被特異性擴(kuò)增。為了確定被克隆的miRNAs與預(yù)測(cè)的pre-miRNAs在結(jié)構(gòu)上的剪切關(guān)系,我們構(gòu)建了miRNA表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HAV-miRNA,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KMB17細(xì)胞和293T細(xì)胞后,預(yù)測(cè)的7個(gè)pre-miRNAs表達(dá)出9個(gè)成熟的miRNAs,從而證明了被克隆的成熟miRNAs是由預(yù)測(cè)的pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切而來。為了確定HAV編碼miRNA的生物學(xué)途徑,我們利用RNAi技術(shù)分別下調(diào)經(jīng)典miRNA合成途徑中的Drosha酶、Dicer酶、Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和AG02蛋白的表達(dá),并檢測(cè)四個(gè)蛋白的表達(dá)被分別下調(diào)后HAV編碼miRNAs水平的變化,結(jié)果證實(shí)HAV編碼miRNAs的過程是一個(gè)依賴Drosha酶、Dicer酶和AG02蛋白,而不依賴Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過程。為了確定候選的miRNAs是否具有典型miRNA所具有的PTGS (Post-transcriptional Gene Silencing)活性特征,我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析了9個(gè)候選miRNAs的PTGS功能活性特征,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：除hav-miR-N1-3p無PTGS活性特征外,其余8個(gè)是真正的具有PTGS功能活性特征的miRNAs分子。時(shí)序性表達(dá)分析表明,HAV編碼的8個(gè)miRNAs在病毒感染細(xì)胞后的4-8小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰,隨后維持在一個(gè)較低的水平。 再次,我們研究了HAV編碼的miRNA對(duì)病毒復(fù)制增殖的調(diào)控作用及作用的分子機(jī)制。靶基因預(yù)測(cè)顯示,HAV編碼的miRNAs與病毒基因組RNA或負(fù)鏈RNA的相應(yīng)區(qū)段完全互補(bǔ)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)HAV編碼的miRNA對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因具有強(qiáng)烈的表達(dá)抑制作用。在HAV與KMB17細(xì)胞互作系統(tǒng)中,利用"gain of function"和"loss of function"的功能研究策略,通過miRNA mimic和miRNA inhibitor上調(diào)和下調(diào)病毒感染細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平,在HAV亞基因組水平和基因組水平證實(shí)了HAV編碼的miRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用,并揭示了這種抑制作用的分子機(jī)制：miRNA以siRNA的作用方式順式裂解病毒的基因組RNA或負(fù)鏈RNA,通過病毒的這種自我靶向作用來抑制病毒基因組的復(fù)制,進(jìn)而達(dá)到抑制病毒自身復(fù)制增殖的目的。 本項(xiàng)研究工作證實(shí)了一類新的由小RNA病毒編碼的miRNA分子,并描述了一種RNA病毒來源的miRNA非經(jīng)典的細(xì)胞質(zhì)加工途徑,同時(shí)也揭示了一種由miRNA介導(dǎo)的小RNA病毒在細(xì)胞中復(fù)制增殖調(diào)控的新機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.61;Q75

【共引文獻(xiàn)】

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1 劉力;李健;喬文濤;耿運(yùn)琪;;MicroRNA在病毒感染調(diào)控作用中的研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2009年06期

2 董原;仇超;徐建青;;病毒miRNA:共生舞者?[J];病毒學(xué)報(bào);2011年06期

3 李臻鵬;李非;余光創(chuàng);應(yīng)德全;伯曉晨;王升啟;;miRNA介導(dǎo)的病毒-人相互作用研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年04期

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1 董尚波;膀胱移行細(xì)胞癌microRNAs的差異表達(dá)初步研究[D];南華大學(xué);2011年

2 李臻鵬;miRNA介導(dǎo)的病毒—宿主網(wǎng)絡(luò)分析[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

3 余光創(chuàng);miRNA靶基因計(jì)算分析新方法及其應(yīng)用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

4 王宇歌;HIV-1感染者血漿microRNA分布變化研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：2788846