【摘要】： 肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變,其本質(zhì)是以膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成增多,而降解相對減少,兩者失去動態(tài)平衡,致使過多的ECM沉積于肝內(nèi),同時伴有肝實質(zhì)的廣泛破壞和再生,導致肝小葉和肝血管結(jié)構(gòu)的紊亂,最終可引起肝功能失代償、腹水、上消化道出血等一系列并發(fā)癥。肝纖維化在進入肝硬化前尚可逆轉(zhuǎn),因此人們十分重視肝纖維化的研究,特別是基礎(chǔ)研究已取得較大的進展,已可從基因水平上認識肝纖維化的治療。目前,常用的一般方法是將足夠的治療性基因?qū)胧軗p的肝臟,使外源性基因得到表達調(diào)控,達到延緩和治愈肝纖維化的目的。 針對肝纖維化的形成機制,其基因治療途徑主要包括抑制HSC的活化、促進ECM降解、抑制間質(zhì)炎癥反應和促進肝細胞增生。目前,主要是在肝臟受到慢性損傷刺激或發(fā)生纖維化后,針對肝纖維化發(fā)生的某些環(huán)節(jié),即針對特定的細胞因子,在體細胞基因水平進行調(diào)控,以達到阻止肝纖維化病理進展的目的。肝纖維化基因治療針對的重要因子包括:轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、表皮生長因子(epidermal growthfactor,EGF)、角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)、肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration, ALR)、白細胞介素(interleukin ,IL)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(inhibitors of MMP ,TIMP)等。 肝細胞生長因子(HGF)可以作為肝纖維化基因治療的一種手段。HGF主要由間質(zhì)細胞衍生的多功能因子,通過自分泌或旁分泌的方式作用于上皮源性的細胞,誘導細胞有絲分裂、促進細胞移動并且對抗細胞因子誘導的凋亡。HGF能調(diào)節(jié)膠原纖維的合成和炎性反應,在治療創(chuàng)傷愈合、防止組織纖維化中起著重要的作用。因此,它在肝纖維化發(fā)病機制中的地位也越來越受到重視。 盡管國內(nèi)外學者已經(jīng)做了許多努力,外源基因?qū)肴梭w組織細胞的安全性和有效性尚難以令人滿意,這也成為基因治療應用于臨床的主要障礙。目前主要有兩類基因載體系統(tǒng):病毒載體和非病毒載體,病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等,非病毒載體包括質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體等。這兩類載體有其各自的優(yōu)缺點;病毒載體在基因轉(zhuǎn)染效率方面有很大優(yōu)勢,但載體本身的安全性限制了其廣泛應用;非病毒載體毒性小、無免疫原性,制劑可高度濃縮,但其基因轉(zhuǎn)染效率遠遠低于病毒載體,且缺乏靶向性。 為了尋找一種更安全、高效的基因轉(zhuǎn)染方法,我們將超聲微泡造影劑作為載體。超聲微泡造影劑(以下簡稱微泡)是由類似紅細胞大小的含氣微泡組成,注入靜脈后能到達紅細胞所能到達的部位,使血流豐富的實質(zhì)器官如心肌、肝臟、腎臟等在二維超聲儀檢測時產(chǎn)生較強對比顯影。新近研究發(fā)現(xiàn),超聲靶向破壞微泡(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)是增強基因轉(zhuǎn)染的方式之一。微泡不但可以作為基因轉(zhuǎn)染的遠程靶向促進劑,在基因傳輸過程中保護基因;而且超聲靶向破壞微泡(UTMD)產(chǎn)生的機械效應和空化效應可使細胞膜通透性增加,并致直徑≤7μm的微血管破裂,內(nèi)皮細胞間隙增寬,靶基因可通過破裂的微血管和內(nèi)皮細胞間隙到達組織細胞內(nèi),同時微泡破裂產(chǎn)生的沖擊波、射流作為一種驅(qū)動力量,可促使從微泡上釋放出來的基因進入靶細胞達到靶向提高基因轉(zhuǎn)染效率目的。因此,超聲靶向破壞微泡(UTMD)具有安全無創(chuàng)、低免疫原性、可反復應用以及器官特異性和超聲可到達靶器官的廣泛適用性等諸多優(yōu)勢。 基于以上理論,本課題通過制備載HGF基因的超聲微泡造影劑,然后運用超聲靶向破壞微泡(UTMD)介導HGF基因治療大鼠肝纖維化,觀察治療后HGF基因在組織細胞內(nèi)的表達情況及治療效?果,為肝纖維化基因治療提供一個新的途徑和手段,為研究和評價超聲靶向破壞微泡(UTMD)介導的肝臟基因轉(zhuǎn)染提供可靠的實驗依據(jù)。 本課題研究主要包括以下三個部分的內(nèi)容: 第一部分載基因脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備 目的制備一種能高效載基因的脂質(zhì)超聲微泡造影劑,評價其物理性質(zhì)、載基因能力和體內(nèi)顯影能力。方法采用層-層吸附(layer-by-layer,LbL)法將HGF基因和多聚賴氨酸(Polylysine ,PLL)分層吸附在自制的脂質(zhì)超聲微泡造影劑上,檢測微泡的形態(tài)、分布、濃度、粒徑、表面電位、載基因能力和體內(nèi)顯影能力。結(jié)果載PLL、載(PLL+DNA)和載(PLL+DNA+PLL)的微泡與空白微泡相比,其形態(tài)、濃度、粒徑?jīng)]有顯著差異;而載(PLL+DNA+PLL+DNA)的微泡粒徑增大,與空白微泡相比差異有統(tǒng)計學意義(p㩳0.05),但其仍然滿足一般造影劑的要求;隨著微泡載PLL和基因的層數(shù)增加,其表面電位向正或負反轉(zhuǎn);同時,隨著載基因微泡外殼吸附基因的層數(shù)增加,載基因量也隨之增加;體內(nèi)造影實驗結(jié)果顯示,載(PLL+DNA+PLL+DNA)的微泡可增強兔肝實質(zhì)顯像,持續(xù)20 min以上。結(jié)論自制的載基因及PLL脂質(zhì)超聲微泡造影劑制備方法簡單、載基因的效率高,可作為攜帶基因等生物活性物質(zhì)的載體材料。 第二部分超聲輻照微泡介導肝細胞生長因子基因體外實驗 目的研究超聲輻照超聲微泡造影劑促進肝細胞生長因子(HGF)基因在大鼠肝星狀細胞株(hepatic stellate cell ,HSC-T6)中的轉(zhuǎn)染效果。 方法將HSC-T6接種在24孔板中,隨機分為以下5組:(1)空白對照組;(2)單純質(zhì)粒組;(3)載基因超聲微泡造影劑組;(4)質(zhì)粒+超聲組;(5)載基因超聲微泡造影劑+超聲組。轉(zhuǎn)染24h后,熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測pIRES2-EGFP/HGF在細胞內(nèi)的表達及轉(zhuǎn)染效率;MTT法檢測該轉(zhuǎn)染方法對HSC-T6生長活性的影響;Western Blot檢測HGF蛋白的表達。結(jié)果載基因超聲微泡造影劑+超聲組的綠色熒光強度及轉(zhuǎn)染率均高于其它各組,并對細胞活性無明顯影響,且HGF蛋白的表達均高于各組(P0.05)。結(jié)論超聲輻照超聲微泡造影劑可提高基因在體外培養(yǎng)HSC-T6的轉(zhuǎn)染效率,并對細胞活性無明顯影響,該方法為提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率提供一個新策略。 第三部分超聲輻照微泡介導肝細胞生長因子基因治療大鼠肝纖維化 目的探討超聲輻照載肝細胞生長因子(HGF)的超聲微泡造影劑治療大鼠肝纖維化的可行性。方法將40只Wistar大鼠建成肝纖維化模型后隨機分為5組,即①超聲+載基因超聲微泡造影劑組(HGF+US/MB),②超聲+單純質(zhì)粒組(HGF+US),③質(zhì)粒+超聲微泡造影劑組(HGF+MB),④單純質(zhì)粒組(HGF),⑤單純模型組(MA)。經(jīng)股靜脈注入超聲微泡造影劑,同時超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照肝區(qū),輻照條件為300 KHz,2 W/cm2,輻照10 s,間隔10 s ,共20 min。于超聲輻照后14 d行磁共振彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging, DWI)檢查;然后處死各組大鼠,取肝組織進行蘇木精/伊紅(hematoxylin/eosin ,HE)染色,觀察肝纖維化恢復情況;病理切片行masson染色,免疫組織化學法(immunohistochemistry ,IHC)檢測肝組織中I型膠原的表達,倒置顯微鏡觀察膠原分布情況; Western Blot檢測HGF蛋白在大鼠肝臟中的表達。結(jié)果HGF+US/MB組的表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient ,ADC)值明顯高于其他各組;相反地,指數(shù)表觀彌散系數(shù)( exponential apparent diffusion coefficient ,EADC)低于其他各組;病理切片HE染色,可見HGF+US/MB組匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生,但肝小葉結(jié)構(gòu)完整,其余各組纖維組織增生程度強于HGF+US/MB組,尤其在MA組,出現(xiàn)假小葉;masson染色結(jié)果與HE染色的結(jié)果一致;IHC結(jié)果顯示,I型膠原被染成棕黃色, HGF+US/MB組明顯少于其他各組,半定量計數(shù)為(0.1752±0.00398),與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。同時,HGF+US/MB組的HGF蛋白的表達均高于其他各組(P0.05)。 結(jié)論超聲靶向破壞微泡能夠介導HGF基因在肝組織內(nèi)高效表達,并產(chǎn)生抗纖維化效應,為肝纖維化的基因治療提供一種新的基因轉(zhuǎn)移途徑。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2
【圖文】：

圖 1-1a 脂質(zhì)超聲造影劑光鏡圖片（×200）Fig.1-1a Light microscopy image of themicrobubbles (×200)圖 1-1b 載 PLL 脂質(zhì)超聲造影劑光鏡圖片（×200）Fig.1-1b Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL (×200)

圖 1-1a 脂質(zhì)超聲造影劑光鏡圖片（×200）Fig.1-1a Light microscopy image of themicrobubbles (×200)圖 1-1b 載 PLL 脂質(zhì)超聲造影劑光鏡圖片（×200）Fig.1-1b Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL (×200)

26圖 1-1c 載 PLL+DNA 脂質(zhì)超聲造影劑光鏡圖片（×200）Fig.1-1c Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL+DNA (×200)圖1-1d 載PLL+DNA+PLL脂質(zhì)超聲造影劑光鏡圖片（×200）Fig.1-1d Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL+DNA+PLL(×200)

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張群霞,王志剛,冉海濤,彭曉瓊,李曉東,彭明利,劉憲華,景香香,楊春江;超聲微泡促進腫瘤細胞報告基因轉(zhuǎn)染[J];臨床超聲醫(yī)學雜志;2005年02期

2 李玲,王志剛;超聲微泡造影劑攜帶基因治療與超聲空化效應[J];臨床超聲醫(yī)學雜志;2005年03期

本文編號：2787156