發(fā)布時(shí)間：2020-08-09 08:53

【摘要】：背景：乙肝病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein，HBx）與損傷DNA結(jié)合蛋白1（damage-specific DNA binding protein1, DDB1)在乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）復(fù)制中發(fā)揮了重要作用。HBV基因組整合到宿主基因組過(guò)程中，HBx蛋白常常發(fā)生斷裂不全，轉(zhuǎn)錄為HBx蛋白的截短體，既往多項(xiàng)研究表明HBx蛋白截短體對(duì)HBV的復(fù)制產(chǎn)生了一定的影響，并且不同截短長(zhǎng)度、不同截短部位的截短體對(duì)HBV的復(fù)制產(chǎn)生的影響也不同。但是，HBx蛋白截短體是否通過(guò)影響DDB1水平來(lái)影響HBV復(fù)制至今尚無(wú)詳細(xì)報(bào)道。 目的：我們的研究將進(jìn)一步探討HBx蛋白及其兩個(gè)截短體（HBx1-101，HBx43-154）與DDB1在HBV復(fù)制中的作用。 方法：使用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，分別提取轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分析方法分別在DDB1基因的mRNA和蛋白水平觀察HBx蛋白及其截短體對(duì)DDB1蛋白的影響。并通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，提取轉(zhuǎn)染72h后各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞胞漿DNA，收集各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞HBV復(fù)制及病毒標(biāo)志物表達(dá)水平，從而觀察HBx蛋白及其兩個(gè)截短體與DDB1對(duì)HBV復(fù)制的影響。 結(jié)果：在有HBV復(fù)制的HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染了HBx C-端截短體HBx1-101的細(xì)胞中DDB1蛋白的表達(dá)水平明顯下降，且不能使缺失HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中HBV的復(fù)制及病毒標(biāo)志物表達(dá)恢復(fù)到野生型水平；而轉(zhuǎn)染N-端截短體HBx43-154的細(xì)胞中DDB1蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染HBx的對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，且能使缺失HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中HBV的復(fù)制及病毒標(biāo)志物表達(dá)恢復(fù)到野生型水平。并且各轉(zhuǎn)染組DDB1蛋白水平變化與HBV復(fù)制水平相平行，即DDB1蛋白水平的降低，使得HBV復(fù)制水平也相應(yīng)降低。 結(jié)論：C-端53個(gè)氨基酸及DDB1蛋白對(duì)于HBV野生型水平的復(fù)制是必需的，而N-端42個(gè)氨基酸對(duì)于HBV復(fù)制水平無(wú)明顯影響。C-端53個(gè)氨基酸對(duì)HBV復(fù)制的影響作用可能是通過(guò)影響DDB1蛋白水平實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62
【圖文】：

分別于轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后24h，48h，72h在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h后熒光蛋白表達(dá)水平最高，轉(zhuǎn)染效率約35%。圖2.1 轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白的表達(dá)Fig2.1 The expression of GFP after 48 h post-transfection under a fluorescence microscope

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2 篩選 DDB1-miRNA 質(zhì)粒以 等 量 的 pcDNA6.2 -GW/ EmGFP-miR （ DDB1 ） 1,2,3 及 陰 性NA6.2 -GW/ EmGFP-miR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞 72h 后提取等量細(xì)胞A，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量 PCR 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 pcDNA6.2 GFP-miR（DDB1）2 的細(xì)胞中 DDB1 在 mRNA 水平上沉默效率最高(約為組的 41.05±2.61)%，于是選擇其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾質(zhì)粒。

圖 2.3 DDB1 蛋白水平的 Western blot 分析1.pSI，2.pSI-X，3.pSI-X1-101，4.pSI-X43-154，5.DDB1-miRNA， blot analysis of DDB1 （Transfected with：Lane 1. pSI, Lane 4. pSI-X43-154, Lane 5. DDB1-miRNA, Lane 6. negative contro HBx 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的 DDB1 蛋白 mRNA 水平的析 pSI-X,pSI，pSI-X1-101，pSI-X43-154分別轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)并以等質(zhì)量 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量 PCR 分析，結(jié)I-X1-101轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中 DDB1 mRNA 水平分別降至 p4）%、（43.16±2.20）%，而 pSI-X43-154轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中變。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉曉紅,朱明華,曹曉哲,鄭建明,陳穎;HBx蛋白羧基端缺失對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J];癌癥;2005年10期

2 張玉霞;徐菲;張旭照;;慢性HBV感染肝組織的C端截短型HBx蛋白功能研究[J];中國(guó)腫瘤;2008年12期

3 彭R

本文編號(hào)：2786896