【摘要】：背景布加綜合征(Budd-Chiari syndrome,BCS)是肝靜脈和(或)其開口以上的下腔靜脈阻塞導(dǎo)致的門靜脈和(或)下腔靜脈高壓臨床癥候群。BCS患者均存在因肝靜脈流出道阻塞所導(dǎo)致的淤血性肝臟損傷。這種肝臟損傷在急性期可表現(xiàn)為肝臟外周帶的血液低灌注區(qū)及細(xì)胞水腫帶,慢性期可表現(xiàn)為因長期肝臟淤血性損傷所導(dǎo)致的肝臟纖維化、肝硬化及肝癌等。BCS導(dǎo)致的淤血性肝臟損傷是一種特殊類型的肝臟損傷,與病毒、中毒、酒精及膽汁淤積等常見因素所導(dǎo)致肝臟損傷相比,有著不同的肝臟損傷機(jī)制,但具體損傷機(jī)制目前尚不清楚。在BCS病程中均存在肝臟淤血;同時長期肝臟淤血還可以導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹壞死,肝臟再生結(jié)節(jié)及纖維間隔形成,腸源性內(nèi)毒素產(chǎn)生增多等現(xiàn)象;這些因素均可導(dǎo)致肝臟血流灌注減少,引起肝內(nèi)缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factors,HIFs)是體內(nèi)最重要的缺氧敏感性核轉(zhuǎn)錄因子,其在體內(nèi)所有組織細(xì)胞對缺氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中均起關(guān)鍵的作用。在機(jī)體缺氧時,無氧代謝增加,可引起HIFs活化,激活靶基因:血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)增加,促進(jìn)血管生成;同時還可導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達(dá)增加,發(fā)揮其擴(kuò)張血管的作用,從而使缺氧的組織細(xì)胞保持氧穩(wěn)態(tài)及耐受低氧狀態(tài)。然而,HIFs過度表達(dá)可導(dǎo)致氧自由基生成增加,通過氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,加重器官的損傷。丙二醛(Malonaldehyde,MDA)是反映氧化應(yīng)激損傷最具代表性的指標(biāo)。MDA可通過活化Kupffer細(xì)胞,使其分泌多種細(xì)胞因子,激活肝星狀細(xì)胞,介導(dǎo)其分化、增殖和膠原合成,參與調(diào)節(jié)肝臟損傷。有研究報道顯示核因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)依賴機(jī)制的炎癥反應(yīng)參與調(diào)節(jié)病毒、中毒、酒精及膽汁淤積等各種因素導(dǎo)致肝臟損傷的進(jìn)程。BCS患者也均存在門靜脈高壓,胃腸道血液回流障礙,腸道淤血水腫,腸道內(nèi)菌群失調(diào)等,這些因素均可導(dǎo)致腸道產(chǎn)生及進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides,LPS)增加。同時BCS患者還存在肝臟淤血缺氧性損傷,因此其肝臟對LPS代謝能力也有所下降。上述這些因素均可導(dǎo)致BCS患者肝臟組織內(nèi)LPS蓄積,進(jìn)而通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號通路激活肝臟組織內(nèi)NF-κB依賴的炎性反應(yīng)介導(dǎo)肝臟損傷的進(jìn)程,但目前尚無此方面的研究證據(jù)。目的1.檢測分析MDA、HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF在BCS動物模型中不同時間點肝臟組織中表達(dá)水平的變化,研究缺氧及缺氧敏感性核轉(zhuǎn)錄因子在BCS導(dǎo)致肝臟損傷進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制。2.檢測分析LPS、TLR4、NF-κB及其下游靶基因[腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-2(Interleukin-2,IL-2)及干擾素-γ(Interferon-γ,INF-γ)]在BCS動物模型中不同時間點肝臟組織中表達(dá)水平的變化,探討NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在BCS致肝臟損傷中的作用機(jī)制。材料與方法180只健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量205-260g,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為9個亞組,每個亞組20只大鼠,模型組和假手術(shù)組各4個亞組(1、3、6、12W亞組),其余一個亞組作為對照組。常規(guī)清潔飼養(yǎng),室溫15℃-25℃,濕度50%-60%。采用部分結(jié)扎下腔靜脈法建立大鼠BCS模型。假手術(shù)組僅分離大鼠下腔靜脈周圍組織,未對下腔靜脈予以結(jié)扎。對照組中大鼠未做任何干預(yù),僅將健康SD大鼠同期飼養(yǎng)6W。各個亞組大鼠術(shù)后飼養(yǎng)至相應(yīng)周齡時存活大鼠均超過12只,按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取12只大鼠處死,開腹取肝左葉組織適量,分別用10%福爾馬林和Bouin氏液固定,用于病理檢測,余肝臟標(biāo)本均置于液氮冷藏備用。所有大鼠在處死前一天均采用數(shù)字減影血管造影(Digital subtraction angiography,DSA)評價大鼠下腔靜脈血流及周圍側(cè)枝血管形成情況。采用HE染色及Masson三色染色法觀察大鼠肝臟病理改變。采用雙抗體夾心法檢測大鼠肝組織勻漿中MDA表達(dá)量。采用鱟試劑法檢測肝組織勻漿中LPS的表達(dá)量。采用 RT-PCR 和 Weston-blotting檢測 HIF-1α、HIF-2α、NF-κB、VEGF、iNOS、TLR4、TNF-α、IL-2及INF-y等相關(guān)指標(biāo)在大鼠肝臟組織中mRNA及蛋白表達(dá)量。采用Levene法檢驗各組數(shù)據(jù)方差齊性。驗證方差齊性后,各因子在模型組、假手術(shù)組及對照組,三組間的總體比較,采用單因素方差分析;模型組與假手術(shù)組兩組間比較,采用兩因素方差分析;各亞組間兩兩比較采用LSD檢驗。以Pearson法做各因子相關(guān)性分析,檢驗水準(zhǔn)設(shè)為0.05,以P0.05為差異有統(tǒng)計意義。結(jié)果1.對照組及假手術(shù)組中所有大鼠下腔靜脈及肝靜脈血流通暢,未見狹窄或閉塞等血管阻塞性病變,亦未見下腔靜脈周圍側(cè)枝血管形成。模型組中48只大鼠均存在肝靜脈開口以上下腔靜脈阻塞,其中35只(72.9%,35/48)肝靜脈開口以上下腔靜脈(即結(jié)扎處)呈重度狹窄,管腔狹窄率85%;另外13只(17.1%,13/48)肝靜脈開口以上下腔靜脈完全閉塞。模型組中1-12W亞組側(cè)枝血管呈逐漸增多、增粗趨勢,以12W亞組最為顯著。假手術(shù)各亞組及對照組中大鼠肝臟病理染色均未見陽性表現(xiàn)。模型組中1W亞組大鼠肝臟亦未見明顯陽性病理改變;3-12W各亞組肝臟均見不同程度淤血性損傷。模型組中3-12W各亞組大鼠肝臟淤血性損傷及肝臟纖維化程度呈逐漸加重趨勢,以12W亞組最為顯著。2.模型組術(shù)后第1、3、6、12W各亞組肝臟勻漿的MDA含量值分別為:(8.55±0.44)nmol/L,(9.63±0.75)nmol/L,(9.36±0.53)nmol/L和(9.13±0.62)nmol/L;均高于假手術(shù)組中對應(yīng)亞組[(6.57±0.41)nmol/L,(6.67±0.48)nmol/L,(6.54±0.57)nmol/L和(6.62±0.46)nmol/L]及對照組(6.61±0.43)nmol/L,三組之間總體比較,差異有統(tǒng)計意義(F=213.6,P0.001);行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),MDA在對照組中表達(dá)量與假手術(shù)各亞組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;而模型組中各亞組MDA表達(dá)量與模型組中其他亞組相比較,亞組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;同時模型組中各亞組MDA表達(dá)量與假手術(shù)各亞組及對照組相比較,亞組間差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組及假手術(shù)各亞組大鼠肝臟組織僅有基礎(chǔ)水平的HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)。模型組中各亞組大鼠肝臟組織中各個因子的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組及假手術(shù)各亞組,各因子三組間的總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(各因子mRNA統(tǒng)計量:F分別為:377.8、536.2、338.0和568.3;各因子蛋白統(tǒng)計量:F分別為:940.4,852.6,627.4和1054.2;P均0.001);行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),各因子在對照組中表達(dá)量與假手術(shù)各亞組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;而各因子在模型組中各亞組的表達(dá)量與模型組中其他亞組相比較,亞組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;同時各因子在模型組中各亞組的表達(dá)量與假手術(shù)各亞組及對照組相比較,亞組間差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組中各亞組MDA、HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF的表達(dá)量均在早期呈逐漸升高趨勢,3W到達(dá)峰值,后期有所下降;但在12W仍明顯高于對照組及假手術(shù)各亞組表達(dá)量。HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF的轉(zhuǎn)錄水平與相應(yīng)蛋白合成均呈高度正相關(guān)(r=0 964,0.953,0.946及0.967;P均0.001)。大鼠BCS模型肝臟組織中HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF各個因子的mRNA及蛋白表達(dá)量均呈高度正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r均0.90,p均0.001。3.模型組術(shù)后第1、3、6、12W各亞組大鼠肝勻漿中LPS的含量值分別為:(1.16±0.08)ng/mL,(1.80±0.10)ng/mL,(1.31 ±0.09)ng/mL 和(1.23±0.10)ng/mL;均高于假手術(shù)組中對應(yīng)亞組[(0.87±0.07ng/mL,(0.86±0.06)ng/mL,(0.85±0.07)ng/mL和(0.85±0.09)ng/mL]及對照組(0.86±0.08)ng/mL,三組間差異有統(tǒng)計意義(F=182.4,P0.001),行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),LPS在對照組中表達(dá)量與假手術(shù)各亞組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;而LPS在模型組中各亞組的表達(dá)量與模型組中其他亞組相比較,亞組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;同時LPS在模型組中各亞組表達(dá)量與假手術(shù)各亞組及對照組相比較,亞組間差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組及假手術(shù)各亞組僅有基礎(chǔ)水平的TLR4、NF-KB、TNF-α、IL-2及INF-γ的mRNA及蛋白表達(dá)。模型組中各亞組肝臟中各個因子的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組及假手術(shù)各亞組,各因子在三組之間總體比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(各因子mRNA統(tǒng)計量:F分別為:333.2、464.0、426.3、555.3和509.2,P均0.001;各因子蛋白統(tǒng)計量:F分別為:291.8、711.8、608.2、897.1和488.5,P均0.001);行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),各因子在對照組的表達(dá)量與假手術(shù)各亞組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;而各因子在模型組中各亞組的表達(dá)量與模型組中其他亞組相比較,亞組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;同時各因子在模型組中各亞組表達(dá)量與假手術(shù)各亞組及對照組相比較,亞組間差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組中各亞組LPS、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-2及INF-γ的表達(dá)量均在早期呈逐漸升高趨勢,3W時到達(dá)峰值,后期有所下降,但直至12W時仍明顯高于對照組及假手術(shù)各亞組表達(dá)量。TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-2及INF-γ的轉(zhuǎn)錄水平與相應(yīng)蛋白合成均呈高度正相關(guān)(r=0 959,0.947,0.956,0.964及0.971;P均0.001)。肝臟中LPS表達(dá)量與TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-2及INF-γ各個因子的mRNA及蛋白表達(dá)量均呈高度正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r均0.90,P均0.001。結(jié)論1.采用部分結(jié)扎大鼠肝后段下腔靜脈的方法,建立BCS動物模型,能夠很好模擬BCS患者的臨床表現(xiàn)、血管病變特征以及病理生理改變,可以為后期BCS基礎(chǔ)研究提供平臺。2.缺氧是BCS導(dǎo)致肝臟損傷一個重要因素和初始因素。3.在BCS導(dǎo)致肝臟損傷進(jìn)程中,機(jī)體可通過活化肝臟組織中HIFs,調(diào)控靶基因(iNOS和VEGF)表達(dá)水平升高,誘導(dǎo)肝內(nèi)外血管擴(kuò)張并建立側(cè)枝血管,緩解肝臟淤血缺氧,調(diào)控BCS導(dǎo)致肝臟損傷的進(jìn)程。4.在整個BCS導(dǎo)致肝臟損傷進(jìn)程中均存在NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。5.LPS可激活TLR4-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)TNF-α、IL-2及INF-γ等炎癥因子的表達(dá),介導(dǎo)肝臟炎性損傷,調(diào)控BCS導(dǎo)致肝臟損傷的進(jìn)程。6.在BCS導(dǎo)致肝臟損傷的早期NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)呈進(jìn)行性加重,后期隨肝內(nèi)、外側(cè)枝血管的建立,炎癥反應(yīng)有所降低,但仍明顯高于正常水平;這說明機(jī)體代償生成側(cè)枝血管可一定程度上緩解肝臟炎性損傷,但無法從根本上解決肝臟炎性損傷。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575
【圖文】：

逑ｍｍ逡逑圖２ａ邐圖２ｂ逡逑１逡逑ｆｆｆ逡逑圖２ｃ邐圖２ｄ逡逑圖２大鼠布加綜合征模型制備圖圖２ａ開腹暴露肝上下腔靜脈；圖２ｂ分離肝上下腔靜脈逡逑周圍組織；圖２ｃ用縫線將４Ｆ導(dǎo)管及下腔靜脈一起結(jié)扎；圖２ｄ撤出４Ｆ導(dǎo)管，隨后逐層縫逡逑合關(guān)腹。逡逑４０逡逑

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圖６大＿干勻裝檢測的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)方程為：Ｙ；０．１７９５４４．７７３７Ｘ，１＾邋＝邋０．９９８５

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2786622