【摘要】：腸出血性大腸桿菌O157:H7(Enterohemorrhagic Escherchia coli O157:H7, EHEC O157:H7)是一種重要食源性病原菌,可引起出血性腸炎(hemorrhagic colitis, HC)和溶血性尿毒綜合征(hemolytic-uremic syndrome, HUS)。1982年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn),我國(guó)1986年在江蘇徐州市首次分離到O157：H7。1999在蘇皖地區(qū)發(fā)生了暴發(fā)流行。EHECO157：H7的主要毒力基因包括噬菌體編碼的志賀毒素、LEE (Locus of enterocyte effacement, LEE)毒力島編碼的緊密黏附素EAE (intimin),質(zhì)粒編碼的溶血素等。我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)1999年蘇皖疫情菌株均攜帶1個(gè)新的38kb的質(zhì)粒pO157_Sal,1999年以后我國(guó)分離的菌株均沒(méi)有這個(gè)質(zhì)粒。功能不明。 本研究應(yīng)用一步缺失法在質(zhì)粒pO157_Sal的CDCO157p2_0036(第36個(gè)基因)和nikB基因之間插入了卡那霉素抗性標(biāo)記基因,并通過(guò)接合試驗(yàn)證明了pO157_Sal具有接合轉(zhuǎn)移功能。使用SDS-變溫方法成功消除了EHECO157:H7Xuzhou21菌株的質(zhì)粒pO157_Sa1,構(gòu)建了質(zhì)粒缺失株Xuzhou21m。將標(biāo)記卡那霉素抗性的pO157_Sal轉(zhuǎn)化入Xuzhou21m,構(gòu)建了質(zhì)粒回補(bǔ)株Xuzhou21c,比較了三株菌在某些表型方面的差異,包括質(zhì)�？截悢�(shù)、酸抗性、stx2轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞毒、刺激細(xì)胞產(chǎn)生血清細(xì)胞因子、鞭毛蛋白FliC的表達(dá)、動(dòng)力以及碳源代謝譜等方面。 我們提取兩株菌的總RINA進(jìn)行測(cè)序,基因的表達(dá)量用RPKM方法進(jìn)行計(jì)算,發(fā)現(xiàn)pO157_Sal上的52個(gè)基因都全部轉(zhuǎn)錄,一共發(fā)現(xiàn)168個(gè)差異表達(dá)基因,其中163個(gè)位于染色體和5個(gè)位于p0157質(zhì)粒。與Xuzhou21m相比,Xuzhou21的上調(diào)基因有67個(gè),下調(diào)基因有101個(gè)。GO注釋和KEGG分類發(fā)現(xiàn),這些差異表達(dá)基因與應(yīng)激反應(yīng)、適應(yīng)不良環(huán)境以及毒力相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。7個(gè)差異表達(dá)基因與脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate, NaDC)抗性相關(guān),包括多藥輸出系統(tǒng)亞單位基因(multidrug efflux system subunit gene, mdtA)、腺嘌呤特異的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(adenine-specific DNA-methyltransferase gene,dam)、高滲透壓誘導(dǎo)的周質(zhì)蛋白基因(hyperosmotically inducible periplasmic protein gene, osm Y)和4個(gè)氧化還原相關(guān)基因(oxidation-reduction related genes)。osmY和跨內(nèi)膜噬菌體休克蛋白基因(peripheral inner membrane phage-shock protein, pspD)與抵抗高滲透壓有關(guān)。有些DEGs是毒力相關(guān)的,包括4個(gè)編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system, T3S S)效應(yīng)蛋白的染色體基因和位于p0157上的腸溶血素D (enterohemolysin, ehxD)基因。DEGs結(jié)果表明質(zhì)粒pO157_Sal可影響染色體和p0157上的基因表達(dá),質(zhì)粒消除株Xuzhou21m在高滲透壓或者含NaDC的M9培養(yǎng)基中比Xuzhou21生長(zhǎng)速度慢；質(zhì)�；匮a(bǔ)株Xuzhou21c恢復(fù)了對(duì)高滲透壓和膽鹽的耐受。 研究發(fā)現(xiàn)位于pO157_Sal質(zhì)粒上的stpA和hha可調(diào)控其他基因的表達(dá)。我們以質(zhì)粒pBAD30為載體,構(gòu)建了stpA和hha的回補(bǔ)株,發(fā)現(xiàn)hha有提高滲透壓和膽鹽耐受的作用,還抑制了某些毒力基因的表達(dá),如T3SS效應(yīng)蛋白espF和espH等。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R574
【圖文】：

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心博士學(xué)位論文 3.結(jié)果3.1質(zhì)粒婉以Xuzhou21為出發(fā)菌株，應(yīng)用一步缺失的方法在p0157—Sal的非編碼區(qū)插入卡那霉素抗性基因。蹄選到了一株具有卡那霉素抗性的Xuzhou21,經(jīng)PCR和測(cè)序證明在CDC0157p2—0036 (第36個(gè)基因）和威基因之間插入了卡那霉素抗性基因，命名為Xuzhou21k。PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

Xuzhou21和Xuzhou21mPCR鑒定

圖 4. Xuzhou21 和 Xuzhou21m 的 PFGE 鑒定H9812, 1和2分別為Xuzhou21和Xuzhou21m用Xbal酶切后的PFGE圖譜；3和4為Xuzhou21和Xuzhou21m未酶切的電泳條帶。

本文編號(hào)：2783523