【摘要】： 重型肝炎的治療是臨床上一大難題，常規(guī)內科治療療效欠佳，肝移植是肝 衰竭的一種有效的治療手段，但面臨著患者病情危重及供體來源困難等情況。人 工肝的研究為重型肝炎的治療提供了一條嶄新的途徑。近年來隨著肝細胞分離， 高密度培養(yǎng)以及生物反應器等技術的日趨成熟，新一代以培養(yǎng)肝細胞為基礎的結 合了非生物人工肝與生物人工肝優(yōu)點的混合型人工肝裝置已成為研究熱點。該方 法在理論上解決了肝衰竭患者體內積累的大量代謝產(chǎn)物及毒性物質難以在有限 的交換中由培養(yǎng)肝細胞解毒的問題，可使人工肝的生物合成轉化功能及解毒作用 更加完善。本研究旨在建立豬肝細胞高質量分離和培養(yǎng)的方法，并對培養(yǎng)肝細胞 的功能和形態(tài)進行研究；使用重型肝炎血漿模型進行生物人工肝的體外實驗，為 臨床應用提供理論基礎；結合血漿置換與生物人工肝裝置，構建一種新型穩(wěn)定安 全的混合型人工肝支持系統(tǒng)，并應用于臨床，驗證其有效性及安全性；對混合型 人工肝系統(tǒng)可能引起的PERV傳播的生物安全性問題進行探討。 1．豬肝細胞的高質量分離和培養(yǎng) 采用改良兩步膠原酶灌注法分離豬肝細胞，接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)l～7d，動 態(tài)觀察肝細胞活率、葡萄糖合成功能、安定轉化功能、上清中白蛋白、LDH濃 度，倒置相差顯微鏡、電鏡觀察培養(yǎng)肝細胞結構。結果顯示肝細胞總數(shù)達 1．510．4八‘中整肝，經(jīng)臺盼蘭染色活率達9215％。肝細胞活率隨培養(yǎng)時間的延長 逐漸下降。經(jīng)id－7d培養(yǎng)后上清液中ALT、AST、LDH的含量隨培養(yǎng)時間的延長顯 著下降（P（．01）；而Alb和 GIOB的合成隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸上升。肝細胞 培養(yǎng)上清中合成的葡萄糖濃度在 1～sh內逐漸上升，以培養(yǎng) id的肝細胞合成葡 萄糖能力最強，3d、sd、7d葡萄糖合成能力達到一個穩(wěn)定水平。培養(yǎng)肝細胞在 3d安定轉化功能最強，此后隨時間延長而降低。電鏡觀察培養(yǎng)1天后肝細胞間 2 2003浙江大學博士學位論文 形成緊密連接和極性。本研究表明，新鮮分離的肝細胞在經(jīng)2～3天的培養(yǎng)后無 論在形態(tài)學還是功能學均處于最佳狀態(tài)。為此我們建議在臨床應用分離肝細胞作 治療時，最好選擇經(jīng)培養(yǎng)2～3天后的肝細胞，以便發(fā)揮其最大功能。 二．使用重型肝炎血漿模型進行生物人工肝的體外實驗 收集重型肝炎血漿置換術患者的被置換血漿，作為生物人工肝治療的血漿 模型。將獲得的總量約 5 XIO’活率在 90％以上的豬肝細胞置于 TECA工型中空 纖維管式生物反應器中預培養(yǎng)4～6h，肝細胞循環(huán)流經(jīng)中空纖維管的外管腔。生 物反應器膜為混合纖維素纖維，孔徑 200urn，分于截留量為 100kD。將收集到的 重型肝炎患者血漿2000ml通過國產(chǎn)蠕動泵的驅動循環(huán)流經(jīng)中空纖維管的內管腔 進行體外循環(huán)共3h。生物人工肝對體外重型肝炎患者血漿進行3小時的循環(huán)處 理后，總膽紅素有明顯下降o＜0刀5） 其余指標未見統(tǒng)計學意義，此外，血漿中 鉀、鈉、氯、鈣等電解質水平亦無明顯變化。實驗前肝細胞活率平均為 92．3士 2．4％， 實驗后肝細胞活率明顯下降，變?yōu)榈叮?士 10．3％，這與重型肝炎血漿中含有大量 毒素經(jīng)半透膜對豬肝細胞產(chǎn)生損害有關，也證明了混合型人工肝先置換去毒再行 生物人工肝治療的設計方法的正確性。應用重型肝炎患者的被置換血漿作為重型 肝炎模型研究生物人工肝對重型肝炎的療效，簡便易行，值得推廣應用。 3．混合型人工肝支持系統(tǒng)的構建及臨床應用 我們在前述豬肝細胞分離及培養(yǎng)的實驗基礎上，結合血漿置換和生物人工 肝，選擇中國實驗用小型豬為肝細胞供體，構建了一種新型的混合型人工肝支持 系統(tǒng)，治療15例重型病毒性肝炎患者。每次治療后患者臨床癥狀不同程度減輕， 乏力、腹脹明顯改善，腹水減少�？偰懠t素在HALSS治療后有明顯下降，PTa 上升，緬氨酸有明顯升高。與非生物型人工肝治療組比較治療后3天的生化指標 3 2003沁［江人學博士學位論義 改變，發(fā)現(xiàn)總膽紅素、直接膽紅素、凝血酶原活動度、內毒素較單純血漿置換組 下降明顯o＜0刀5卜 治愈好轉率明顯升高。15例患者中10例經(jīng)混合型人工肝支 持系統(tǒng)治療肝細胞迅速壞死得到控制，在度過肝功能衰竭難關后接受進一步常規(guī) 內科治療，最終均好轉出院；1例患者經(jīng)過混合型人工肝支持治療后成功地等到 了供肝，進行了肝移植并存活至今；4例患者病情未好轉死亡。所有患者在治療 中及治療后12小時內未出現(xiàn)嚴重不良反應，除1例患者在治療中出現(xiàn)輕微過敏 反應，經(jīng)對癥處理后得到糾正，并繼續(xù)接受混合人工肝支持治療。我們構建的混 合性人工肝支持系統(tǒng)對于慢性重型肝炎是一種安全有效的輔助支持和治療手段， 值得進一步擴大病例數(shù)進行深入臨床應用研究。 4．HBLSS治療中豬內源性逆轉錄病毒0
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R575.1
【圖文】：

::::介U00介11505nU71，一2‘.1Marker;N:陰性對照:P:陽性對照;S:豬肝細胞培養(yǎng)上清;1一11:LSS治療后病人血清標本HBLSS治療后病人血清PERVPCR擴增產(chǎn)物電泳圖

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 中華醫(yī)學會傳染病與,寄生蟲病學分會,肝病學分會;病毒性肝炎防治方案[J];中華肝臟病雜志;2000年06期

本文編號：2780532