【摘要】： 重型肝炎的治療是臨床上一大難題，常規(guī)內(nèi)科治療療效欠佳，肝移植是肝 衰竭的一種有效的治療手段，但面臨著患者病情危重及供體來源困難等情況。人 工肝的研究為重型肝炎的治療提供了一條嶄新的途徑。近年來隨著肝細(xì)胞分離， 高密度培養(yǎng)以及生物反應(yīng)器等技術(shù)的日趨成熟，新一代以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的結(jié) 合了非生物人工肝與生物人工肝優(yōu)點(diǎn)的混合型人工肝裝置已成為研究熱點(diǎn)。該方 法在理論上解決了肝衰竭患者體內(nèi)積累的大量代謝產(chǎn)物及毒性物質(zhì)難以在有限 的交換中由培養(yǎng)肝細(xì)胞解毒的問題，可使人工肝的生物合成轉(zhuǎn)化功能及解毒作用 更加完善。本研究旨在建立豬肝細(xì)胞高質(zhì)量分離和培養(yǎng)的方法，并對(duì)培養(yǎng)肝細(xì)胞 的功能和形態(tài)進(jìn)行研究；使用重型肝炎血漿模型進(jìn)行生物人工肝的體外實(shí)驗(yàn)，為 臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)；結(jié)合血漿置換與生物人工肝裝置，構(gòu)建一種新型穩(wěn)定安 全的混合型人工肝支持系統(tǒng)，并應(yīng)用于臨床，驗(yàn)證其有效性及安全性；對(duì)混合型 人工肝系統(tǒng)可能引起的PERV傳播的生物安全性問題進(jìn)行探討。 1．豬肝細(xì)胞的高質(zhì)量分離和培養(yǎng) 采用改良兩步膠原酶灌注法分離豬肝細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)l～7d，動(dòng) 態(tài)觀察肝細(xì)胞活率、葡萄糖合成功能、安定轉(zhuǎn)化功能、上清中白蛋白、LDH濃 度，倒置相差顯微鏡、電鏡觀察培養(yǎng)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示肝細(xì)胞總數(shù)達(dá) 1．510．4八‘中整肝，經(jīng)臺(tái)盼蘭染色活率達(dá)9215％。肝細(xì)胞活率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) 逐漸下降。經(jīng)id－7d培養(yǎng)后上清液中ALT、AST、LDH的含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯 著下降（P（．01）；而Alb和 GIOB的合成隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升。肝細(xì)胞 培養(yǎng)上清中合成的葡萄糖濃度在 1～sh內(nèi)逐漸上升，以培養(yǎng) id的肝細(xì)胞合成葡 萄糖能力最強(qiáng)，3d、sd、7d葡萄糖合成能力達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定水平。培養(yǎng)肝細(xì)胞在 3d安定轉(zhuǎn)化功能最強(qiáng)，此后隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。電鏡觀察培養(yǎng)1天后肝細(xì)胞間 2 2003浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 形成緊密連接和極性。本研究表明，新鮮分離的肝細(xì)胞在經(jīng)2～3天的培養(yǎng)后無 論在形態(tài)學(xué)還是功能學(xué)均處于最佳狀態(tài)。為此我們建議在臨床應(yīng)用分離肝細(xì)胞作 治療時(shí)，最好選擇經(jīng)培養(yǎng)2～3天后的肝細(xì)胞，以便發(fā)揮其最大功能。 二．使用重型肝炎血漿模型進(jìn)行生物人工肝的體外實(shí)驗(yàn) 收集重型肝炎血漿置換術(shù)患者的被置換血漿，作為生物人工肝治療的血漿 模型。將獲得的總量約 5 XIO’活率在 90％以上的豬肝細(xì)胞置于 TECA工型中空 纖維管式生物反應(yīng)器中預(yù)培養(yǎng)4～6h，肝細(xì)胞循環(huán)流經(jīng)中空纖維管的外管腔。生 物反應(yīng)器膜為混合纖維素纖維，孔徑 200urn，分于截留量為 100kD。將收集到的 重型肝炎患者血漿2000ml通過國(guó)產(chǎn)蠕動(dòng)泵的驅(qū)動(dòng)循環(huán)流經(jīng)中空纖維管的內(nèi)管腔 進(jìn)行體外循環(huán)共3h。生物人工肝對(duì)體外重型肝炎患者血漿進(jìn)行3小時(shí)的循環(huán)處 理后，總膽紅素有明顯下降o＜0刀5） 其余指標(biāo)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，血漿中 鉀、鈉、氯、鈣等電解質(zhì)水平亦無明顯變化。實(shí)驗(yàn)前肝細(xì)胞活率平均為 92．3士 2．4％， 實(shí)驗(yàn)后肝細(xì)胞活率明顯下降，變?yōu)榈叮?士 10．3％，這與重型肝炎血漿中含有大量 毒素經(jīng)半透膜對(duì)豬肝細(xì)胞產(chǎn)生損害有關(guān)，也證明了混合型人工肝先置換去毒再行 生物人工肝治療的設(shè)計(jì)方法的正確性。應(yīng)用重型肝炎患者的被置換血漿作為重型 肝炎模型研究生物人工肝對(duì)重型肝炎的療效，簡(jiǎn)便易行，值得推廣應(yīng)用。 3．混合型人工肝支持系統(tǒng)的構(gòu)建及臨床應(yīng)用 我們?cè)谇笆鲐i肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合血漿置換和生物人工 肝，選擇中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬為肝細(xì)胞供體，構(gòu)建了一種新型的混合型人工肝支持 系統(tǒng)，治療15例重型病毒性肝炎患者。每次治療后患者臨床癥狀不同程度減輕， 乏力、腹脹明顯改善，腹水減少�？偰懠t素在HALSS治療后有明顯下降，PTa 上升，緬氨酸有明顯升高。與非生物型人工肝治療組比較治療后3天的生化指標(biāo) 3 2003沁［江人學(xué)博士學(xué)位論義 改變，發(fā)現(xiàn)總膽紅素、直接膽紅素、凝血酶原活動(dòng)度、內(nèi)毒素較單純血漿置換組 下降明顯o＜0刀5卜 治愈好轉(zhuǎn)率明顯升高。15例患者中10例經(jīng)混合型人工肝支 持系統(tǒng)治療肝細(xì)胞迅速壞死得到控制，在度過肝功能衰竭難關(guān)后接受進(jìn)一步常規(guī) 內(nèi)科治療，最終均好轉(zhuǎn)出院；1例患者經(jīng)過混合型人工肝支持治療后成功地等到 了供肝，進(jìn)行了肝移植并存活至今；4例患者病情未好轉(zhuǎn)死亡。所有患者在治療 中及治療后12小時(shí)內(nèi)未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，除1例患者在治療中出現(xiàn)輕微過敏 反應(yīng)，經(jīng)對(duì)癥處理后得到糾正，并繼續(xù)接受混合人工肝支持治療。我們構(gòu)建的混 合性人工肝支持系統(tǒng)對(duì)于慢性重型肝炎是一種安全有效的輔助支持和治療手段， 值得進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)行深入臨床應(yīng)用研究。 4．HBLSS治療中豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒0
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R575.1
【圖文】：

::::介U00介11505nU71，一2‘.1Marker;N:陰性對(duì)照:P:陽性對(duì)照;S:豬肝細(xì)胞培養(yǎng)上清;1一11:LSS治療后病人血清標(biāo)本HBLSS治療后病人血清PERVPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與,寄生蟲病學(xué)分會(huì),肝病學(xué)分會(huì);病毒性肝炎防治方案[J];中華肝臟病雜志;2000年06期

本文編號(hào)：2780532