【摘要】： 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是近年來(lái)逐漸認(rèn)識(shí)到的十分常見(jiàn)的慢性肝病,包括單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)和NASH相關(guān)性肝纖維化及肝硬化。NASH具有脂肪變性、肝細(xì)胞損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變,可發(fā)展演化為肝硬化、肝癌,一般預(yù)后較差。NASH的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,目前普遍接受的是以胰島素抵抗(insulinresistance,IR)、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化為中心的“二次打擊”學(xué)說(shuō)。 肝細(xì)胞內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸以及儲(chǔ)存鈣的主要場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)各種刺激極為敏感,當(dāng)機(jī)體功能紊亂時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂的狀態(tài),稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS主要激活三條信號(hào)通路:未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)、超負(fù)荷反應(yīng)(endoplasmic reticulum overload response,EOR)和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。近年來(lái)對(duì)于ERS信號(hào)通路及其效應(yīng)在代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)如肥胖、IR和2型糖尿病等中的研究十分廣泛。因此,我們認(rèn)為作為與MS密切相關(guān)的NASH,其發(fā)病機(jī)制可能與ERS信號(hào)通路存在重要的聯(lián)系。 既往研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧(reactive oxygenspecies,ROS),而ROS又是ERS的重要誘發(fā)因素,因此我們推測(cè)當(dāng)高脂飲食引起脂肪酸過(guò)載時(shí),通過(guò)產(chǎn)生ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物觸發(fā)肝絀胞發(fā)生ERS,啟動(dòng)UPR和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)途徑,其中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element bindingprotein,SREBP-1c)表達(dá)上調(diào),可增加脂肪合成酶等的表達(dá),造成脂肪酸合成異常增多,肝臟脂質(zhì)代謝障礙;當(dāng)出現(xiàn)過(guò)強(qiáng)或者持久刺激時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂得不到修正,造成UPR過(guò)載,激發(fā)氧化應(yīng)激,引起脂肪變的肝細(xì)胞發(fā)生變性和壞死,從而導(dǎo)致NASH的發(fā)生。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)ERS時(shí)UPR和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的標(biāo)志性分子在高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NASH形成中的表達(dá)變化,初步探討ERS在NASH形成中的作用及意義。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下: 研究?jī)?nèi)容和方法: Wistar成年雄性大鼠30只,隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)與NASH組。其中NASH組分為4、8、12、16周4個(gè)時(shí)相點(diǎn),各時(shí)相點(diǎn)隨機(jī)分配6只動(dòng)物。C組給予基礎(chǔ)飼料,NASH組給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料82.5%,豬油10%,膽固醇2%,蔗糖5%,膽鹽0.5%)。動(dòng)態(tài)觀察各組:①HE染色光鏡觀察肝臟組織病理改變;②血清FFA、TG、ALT、AST含量的測(cè)定;③肝組織MDA、FFA、ROS含量的測(cè)定;④半定量RT-PCR檢測(cè)ERS標(biāo)志物GRP78、UPR標(biāo)志物ATF6和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)標(biāo)志物SREBP-1c mRNA的表達(dá)變化;⑤相對(duì)定量PCR檢測(cè)GRP78、ATF6 mRNA的表達(dá)變化;⑥Western blot法檢測(cè)GRP78、ATF6、Phospho-PERK、SREBP-1c的蛋白表達(dá)變化。 研究結(jié)果: 1、HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變 結(jié)果顯示C組大鼠肝臟大體形態(tài)和病理切片均正常。高脂喂養(yǎng)4、8、12、16周后,肉眼可見(jiàn)大鼠肝臟色澤變黃,包膜緊張,邊緣圓鈍,切面黃色、油膩,組織松脆;隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),病理學(xué)可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變及氣球樣變,小葉中央?yún)^(qū)炎癥,腺泡3帶出現(xiàn)點(diǎn)灶狀壞死,并逐漸發(fā)展至門管區(qū)輕～中度炎癥。按非酒精性脂肪性肝病診療指南劃分為:NASH-F1G0期、F2G1期、F3G2期、F4G3期。 2、血清FFA、TG、ALT、AST的含量變化 高脂喂養(yǎng)4周后,G0組血清FFA、TG、AST含量逐漸升高,隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),G1和G2組血清中FFA、TG、ALT、AST含量明顯增高,在16周G3組時(shí)達(dá)到高峰,與C組相比相差非常顯著(P＜0.01)。 3、肝組織MDA、FFA、ROS的含量變化 高脂喂養(yǎng)NASH各組大鼠肝組織MDA含量與C組相比顯著升高(P＜0.01)。肝組織FFA、ROS含量由高脂喂養(yǎng)4周時(shí)開(kāi)始逐步升高,16周上升最為明顯(P＜0.01)。 4、半定量RT-PCR檢測(cè)GRP78、ATF6和SREBP-1c mRNA表達(dá)變化 高脂喂養(yǎng)4周后,GRP78和SREBP-1c mRNA水平隨肝細(xì)胞脂肪變和炎癥程度的加重而升高,在G3組中達(dá)到高峰(P＜0.01)。ATF6 mRNA水平在G0組與C組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05),在G1、G2、G3組時(shí)與C組相比明顯升高(P＜0.01)。 5、相對(duì)定量PCR檢測(cè)GRP78、ATF6 mRNA的表達(dá)變化 將C組樣本設(shè)為對(duì)照,得出NASH各組樣本中目的基因GRP78和ATF6相對(duì)對(duì)照樣本的含量比值。結(jié)果顯示NASH各組GRP78和ATF6 mRNA的表達(dá)水平與C組相比升高(P＜0.05),與半定量RT-PCR結(jié)果趨勢(shì)一致。 6、Western blot法檢測(cè)GRP78、ATF6、Phospho-PERK和SREBP-1c蛋白表達(dá)變化 高脂喂養(yǎng)4周后,GRP78、ATF6和SREBP-1c蛋白表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),并隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高,在G3組時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01)。Phospho-PERK蛋白水平在喂養(yǎng)4周時(shí)與C組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05),在G3組時(shí)達(dá)高峰(P＜0.01)。 結(jié)論: 1、高脂飲食誘導(dǎo)FFA生成增加,在FFA氧化過(guò)程中產(chǎn)生大量ROS、MDA,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物在肝臟內(nèi)過(guò)度累積,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的因素增加; 2、在大鼠NASH形成過(guò)程中,ERS標(biāo)志物GRP78和UPR標(biāo)志物ATF6、Phospho-PERK以及固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)標(biāo)志物SREBP-1c表達(dá)水平有隨著肝臟炎癥程度不斷加重而升高的趨勢(shì); 3、高脂飲食引起ROS等應(yīng)激因素增加,通過(guò)啟動(dòng)UPR聯(lián)合SREBP-1c造成ERS過(guò)度,表現(xiàn)為GRP78、ATF6、Phospho-PERK以及SREBP-1c表達(dá)水平升高,一方面增強(qiáng)脂肪酸相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變,另一方面通過(guò)UPR作用最終導(dǎo)致NASH形成。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575
【圖文】：

其它雜帶出現(xiàn)，285及185帶亮度強(qiáng)、比例高，55帶亮度弱，同時(shí)結(jié)合分光光度計(jì)測(cè)定RNA的光密度值(即00260/Oo28oL匕值)，均在1.8一2.0之間，表明提取的總RNA完整性好、純度高，降解很少，可用于下一步試驗(yàn)(見(jiàn)圖6)。之55185圖6人鼠丹卜組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒足2、RT--PCR檢測(cè)大鼠肝臟 GRP78mRNA表達(dá)變化由表6、圖7及圖8可見(jiàn)各組各時(shí)相點(diǎn)均有 GRP78mRNA陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，GRP78片段擴(kuò)增長(zhǎng)度為385bp。NAsH組從4周開(kāi)始，Go組大鼠肝組織GRP78基因mRNA轉(zhuǎn)錄增多，8周、12周表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，16周達(dá)高峰(P<0.01)。表 6GRP78mRNA在人鼠月十纖I織中的表達(dá)變化行士s，n=6)NASH夕日C織GO全日GI鄉(xiāng)日GZ全[{G3全11 0.27士0.04 0.63士0.14日 0.81士 0.1lb0.96士0.14b 1.27士0.26a:P<0.05，b:P<0.01’、又寸!!暇夕日L一匕較

SRI紐P.le(311帥)圖12大鼠肝組織SREBP一1cmRNART-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果、相對(duì)定量PCR檢測(cè)大鼠肝組織GRP78、ATF6mRNA表達(dá)變化、分管同板相同條件下RealTimepCR檢測(cè)待測(cè)樣品CyelophilinA、GRP表達(dá)，通常將反應(yīng)開(kāi)始的3一巧循環(huán)中檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化的平均值于基線10%的熒光強(qiáng)度定為閉值(threshold)，熒光強(qiáng)度的變化與PCR產(chǎn)正比。反應(yīng)結(jié)束后，給出PCR熔解曲線及擴(kuò)增曲線(圖13、14)。

圖14Cyelophili認(rèn)、G即78、ATF6擴(kuò)增曲線2、大鼠肝組織GRP78、Al下6InRNA表達(dá)變化我們將C組樣本設(shè)為對(duì)照，得出NASH各組樣本中目的基因GRP78和AT照樣本的含量比值。從表9和圖巧可以看出，GRP78和ATF6mRNA的表C組相比升高(P<0.05)，并與半定量RT-PCR趨勢(shì)一致。表gG即78、ATF6mRNA在大鼠肝組織中的表達(dá)變化(牙士S，n=6)基因C組NASH組GI組G3組GRP781.00士0.001.28士0.221.57士0.12aGZ組2.01士0.1ga2.30士1.20AI下61.00士0.001.02士0.231.35士0.14a1.56士0.11“1.77士0.25aa:P<0.05與對(duì)照組比較DGRP78日ATF6

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 謝加力;ERS與TRAIL在大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系探討[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2774604