【摘要】： 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78(GRP78)最早是從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被發(fā)現(xiàn)的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的GRP78主要的生物學(xué)功能是參與鈣平衡的調(diào)節(jié),新生蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜遷移以及蛋白質(zhì)的折疊,成熟,轉(zhuǎn)運(yùn)及逆轉(zhuǎn)運(yùn)等。除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外,細(xì)胞的膜上也有GRP78表達(dá)。有研究者提出細(xì)胞膜上的GRP78可以作為受體分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子而存在。而隨后的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn):GRP78是2型登革熱病毒在肝細(xì)胞膜上的受體復(fù)合物的成分之一,也是A9型科薩奇病毒的共受體分子之一,細(xì)胞表面的GRP78分子在信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗原的呈遞等方面都有作用。 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)的感染是威脅人類生命健康的全球性的公共衛(wèi)生問題之一。我們對(duì)HBV基因的組成、復(fù)制、抗原的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性等方面已經(jīng)有比較深入的了解,但是由于缺乏合適的體外感染的模型使我們對(duì)HBV早期的感染過程,如HBV的黏附、脫殼等過程都沒有深入的了解。目前絕大多數(shù)的研究都認(rèn)為HBV主要可能是通過病毒表面的大蛋白(large surface HBV antigen,LHBs)preS1特異性地與人肝細(xì)胞膜上的特異受體發(fā)生識(shí)別和黏附,從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),啟動(dòng)病毒的復(fù)制周期。本課題組在前期研究中以重組的融合蛋白GST-preS1為探針蛋白,采用pull down的技術(shù)直接分離出能夠與preS1結(jié)合的HepG2細(xì)胞膜蛋白成分,并進(jìn)一步通過質(zhì)譜分析,鑒定出該蛋白為GRP78。 本課題首先利用了熒光抗體標(biāo)記的技術(shù),通過激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope, LSCM)觀察到了GRP78在HepG2的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中均有表達(dá),在細(xì)胞膜上呈均勻的分布,證實(shí)了GRP78是HepG2細(xì)胞的膜成分之一。我們利用了RT-PCR方法直接從HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增出GRP78的cDNA序列,利用了基因重組技術(shù)將GRP78及其分段表達(dá)的GRP78N, GRP78C與His標(biāo)簽在原核系統(tǒng)中進(jìn)行融合表達(dá),成功的構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒PW28-GRP78,PW28-GRP78 N和PW28-GRP78C ,并成功的誘導(dǎo)了重組蛋白His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C的原核表達(dá)及純化。利用實(shí)驗(yàn)室原有的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST-preS1重組的融合蛋白為配體蛋白,采用pull down技術(shù)和間接ELISA的方法檢測(cè)GRP78與其分段表達(dá)的融合蛋白與preS1的體外結(jié)合試驗(yàn)。結(jié)果顯示preS1可以與GRP78特異性地結(jié)合,特別是與GRP78的N段,與His標(biāo)簽無關(guān),且與HBV呈劑量依賴性。在此基礎(chǔ)上,我們成功構(gòu)建了pcDNA3.1-GRP78真核表達(dá)載體,并通過Western blot和激光共聚焦顯微鏡都觀察到了GRP78在HEK293細(xì)胞中成功地表達(dá)。 本課題的研究結(jié)果提示了GRP78可能作為HBV感染肝細(xì)胞的早期過程中起關(guān)鍵作用的候選分子之一。我們的研究為進(jìn)一步地研究HBV入侵人肝細(xì)胞的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

4）去封閉液，加入按 1：100 比例稀釋的兔抗 GRP78 的一抗，在 4 ℃條件下過孵育；5）去一抗溶液，用 PBS 充分地漂洗玻片，后加入按 1：400 的比例稀釋的 FIT標(biāo)記的二抗，在室溫條件下避光孵育 2 小時(shí)；6）去二抗溶液，在避光環(huán)境下 PBS 充分漂洗爬片細(xì)胞；7）用水溶性封片劑甘油進(jìn)行封片，在 LSCM 下觀察 GRP78 在細(xì)胞中的分布情2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 GRP78 在 HepG2 細(xì)胞上的分布將 HepG2 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片后以抗 GRP78 為一抗進(jìn)行標(biāo)記，用 FITC 標(biāo)記二抗進(jìn)行追蹤標(biāo)記，在激光共聚焦顯微鏡下觀察 GRP78 在 HepG2 細(xì)胞中的分布況。如圖 1.1 所示：GRP78 在 HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，GRP在細(xì)胞膜上呈均勻的分布。

圖 2.2 1%瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物圖 2.3 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig 2.2 Analysis of PCR products by 1%agarose gel electrophoresisFig 2.3 Identification of recombinant plasmids byenzyme digestionM: DL2000 DNA MarkerLane1: GRP78 PCR productLane2: GRP78N PCR productLane3: GRP78C PCR productLane1,3,5,7,9,11: recombinant plasmid; Lane2,4：digestedrecombinant plasmid PW28-GRP78Lane6,8: digested recombinant plasmid PW28-GRP78N;Lane10,12: digested recombinant plasmid PW28-GRP78C2.3 重組融合蛋白 His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C 的表達(dá)和純化將重組表達(dá)質(zhì)粒 PW28-GRP78,PW28-GRP78N,PW28-GRP78C 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21 后，融合蛋白在 IPTG 的誘導(dǎo)下有表達(dá)。菌體裂解液上清的 PAGE 電泳的

圖 2.2 1%瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物圖 2.3 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig 2.2 Analysis of PCR products by 1%agarose gel electrophoresisFig 2.3 Identification of recombinant plasmids byenzyme digestionM: DL2000 DNA MarkerLane1: GRP78 PCR productLane2: GRP78N PCR productLane3: GRP78C PCR productLane1,3,5,7,9,11: recombinant plasmid; Lane2,4：digestedrecombinant plasmid PW28-GRP78Lane6,8: digested recombinant plasmid PW28-GRP78N;Lane10,12: digested recombinant plasmid PW28-GRP78C2.3 重組融合蛋白 His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C 的表達(dá)和純化將重組表達(dá)質(zhì)粒 PW28-GRP78,PW28-GRP78N,PW28-GRP78C 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21 后，融合蛋白在 IPTG 的誘導(dǎo)下有表達(dá)。菌體裂解液上清的 PAGE 電泳的

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本文編號(hào)：2772227