【摘要】：目的:探討核自噬與肝細(xì)胞脂變的相關(guān)性,從核自噬的新角度闡明肝細(xì)胞脂變的發(fā)病新機(jī)理,以期為非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的切入靶點(diǎn)。方法:1.體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞WRL68細(xì)胞,應(yīng)用不同濃度的游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)(油酸:棕櫚酸=2:1)誘導(dǎo)WRL68細(xì)胞脂肪變,選出最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間,建立脂肪肝細(xì)胞模型;2.將WRL68細(xì)胞分為兩組,分別為正常對照組(Control)及FFA誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂變組;分別于不同時(shí)間段用自動生化儀檢測甘油三脂及膽固醇的含量,結(jié)合油紅“O”染色結(jié)果,以評估肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積程度;3.電子透射鏡觀察各組肝細(xì)胞中核自噬現(xiàn)象;4.應(yīng)用Western blot技術(shù)在不同時(shí)間段分別檢測胞質(zhì)中及胞核中LC3、LaminB1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積結(jié)果顯示:用不同濃度FFA(0mmol/l、0.25mmol/l、0.5mmol/l)分別處理WRL68細(xì)胞6h、24h及48h,誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變。成功建立肝細(xì)胞脂變模型,結(jié)合油紅染色結(jié)果及細(xì)胞內(nèi)TG、TC值,FFA誘導(dǎo)濃度以0.5mM為最佳,且誘導(dǎo)后24h為觀察表型現(xiàn)象最佳時(shí)間。2、透射電鏡下可見:無法很清晰地看到核內(nèi)的自噬情況。但在胞質(zhì)中,培養(yǎng)1h觀察,與對照組相比,0.5mM FFA處理組出現(xiàn)少量囊狀小泡,部分小泡內(nèi)可見細(xì)胞器。在處理24h后,FFA處理組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含細(xì)胞器的囊狀小泡基本不可見。3、Western blot檢測WRL68細(xì)胞中LC3、LaminB1的表達(dá)結(jié)果顯示:在胞核中,經(jīng)FFA誘導(dǎo)后,LaminB1表達(dá)量較control組明顯升高,而LC3II表達(dá)量較control組比呈下降趨勢。在胞質(zhì)中,LaminB1幾乎不表達(dá);在培養(yǎng)6-24h后,FFA誘導(dǎo)組較control組LC3II表達(dá)量呈增加趨勢,而LC3II/I的值明顯呈下降趨勢;在培養(yǎng)48h后,FFA誘導(dǎo)組LC3II蛋白的表達(dá)量control組降低,但LC3II/I值升高。結(jié)論:核自噬受抑參與肝細(xì)胞脂變過程,可能成為干預(yù)肝細(xì)胞脂變的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.5
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 FFA 處理細(xì)胞后油紅染色檢測脂質(zhì)變化情況分別用不同濃度的 FFA（0mmol/l、0.25mmol/l、0.5mmol/l）誘導(dǎo) WR胞脂肪變，濃度為 0.25mMFFA 處理 24h 后，WRL68 細(xì)胞內(nèi)可見許多紅色脂濃度為 0.5mMFFA 處理 24h 后，WRL68 細(xì)胞可見大量紅色脂粒；用不同濃度處理 48h 后，趨勢一致。（見圖 1）結(jié)果表明：以 0.5mM FFA 誘導(dǎo)為最佳誘導(dǎo)濃度，24h 為觀察表型現(xiàn)象所佳時(shí)間。0mM 0.25mM 0.5mM

檢測 FFA 誘導(dǎo)組肝細(xì)胞 TG 及 TC 含量，與 control 組相比較，TG 及 TC 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且隨著時(shí)間的增加，即誘導(dǎo) 24h 后較control 組相比，TG 及 TC 含量明顯升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng) FFA 誘導(dǎo)后，隨著時(shí)間的增加，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積進(jìn)一步加重。（見表 1、圖 2）表 1 不同處理組 TG 及 TC 值的變化(mmol/l)（ x±s，n＝3）分組 TG TCcontrol 0.0167±0.0058 0.0367±0.00586h FFA 0.0367±0.0058* 0.0630±0.0058*24h FFA 0.0867±0.0058# 0.1300±0.0100#注：與 control 組相比，*p<0.05；與 control 組相比，#p<0.01。

圖 3.電子透射鏡下觀察核自噬（X5000-20000）：第一列圖片（X5000）；第二列圖片（X10000）；第三列圖片（X20000）WB 檢測 LC3B、LaminB1 蛋白表達(dá)情況噬相關(guān)基因 LC3 定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，核和核膜相關(guān)的 LC3 蛋白似乎C3-II 形式存在[21]。而當(dāng)自噬形成時(shí)，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會酶解多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即 LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大自噬水平的高低[23]。且 LC3-Ⅱ水平與自噬體數(shù)量密切相關(guān)，是自噬體好標(biāo)志[24]。而 LaminB1 可以與 LC3 相互作用，因此，LC3-II 及 Lamin達(dá)量可估計(jì)核自噬水平的高低。在上面的電鏡下在細(xì)胞核中未觀察到自小體的形成，為了檢測核自噬的情況，我們通過分別檢測細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞中 LC3B、LaminB1 的水平來評估核自噬的情況。同時(shí)因 LC3B 抗體對II 又更高的親和力，通常 LC3B I 的減少并不與 LC3B II/I 的增加同步，

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本文編號：2769517