發(fā)布時間：2020-07-24 05:41

【摘要】： 第一部分乙型肝炎病毒X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建乙型肝炎病毒(HBV)X基因與pCI-neo相融合的高效真核表達(dá)載體，為進一步研究HBV X基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法：設(shè)計并合成HBV X基因的引物，以HBV DNA陽性血清PCR擴增得到HBV X基因全序列，將X基因連接到真核表達(dá)載體pCI-neo，構(gòu)成pCI-neo-X質(zhì)粒，然后用酶切圖譜分析、PCR檢測和擴增產(chǎn)物序列分析等方法，鑒定所構(gòu)建的真核表達(dá)載體。結(jié)果：以重組載體為模板擴增得到的片段大小與已知HBV X基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，測序結(jié)果也顯示與已知X基因序列相同。結(jié)論：成功構(gòu)建了HBV X基因的真核表達(dá)載體，為進一步研究HBVX基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分乙型肝炎病毒X基因轉(zhuǎn)染對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖以及腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6表達(dá)的影響 目的探討HBV X基因表達(dá)的蛋白(HBx)對體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6及細(xì)胞增殖的影響。方法將前面構(gòu)成的pCI-neo-X真核表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體法將pCI-neo-X轉(zhuǎn)染給體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞，Westem blot測定HBx的表達(dá)；以半定量反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR測定體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6。甲基噻唑基四唑(MTT)法測定細(xì)胞增殖。結(jié)果轉(zhuǎn)染pCI-neo-X的系膜細(xì)胞，HBx在36和48小時表達(dá)明顯。同時半定量反轉(zhuǎn)錄PCR測定顯示TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體組明顯增高。培養(yǎng)36和48小時后上清液中TNF-α水平在轉(zhuǎn)染pCI-neo-X組、未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體組分別為(185．3±70．7)pg／ml，(41．7±10．3)pg／ml，(44．0±10．1)pg／ml，(140．3±42．1)pg／ml，(43．7±10．6)pg／ml，(33．3±8．6)pg／ml；IL-1β水平分別為(402±60)pg／ml，(182±23)pg／ml，(170±18)pg／ml，(432±58)pg／ml，(181±20)pg／ml，(165±19)pg／ml；IL-6水平分別為(177．0±18．2)pg／ml，(85．7±16．9)pg／ml，(69．7±22．2)pg／ml，(179．7±26．3)pg／ml，(70．0±18．3)pg／ml，(73．0±14．0)pg／ml，pCI-neo-X組與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體組比較，均有顯著性差異(p＜0．05)；細(xì)胞增殖在36和48小時pCI-neo-X組最明顯，吸光度分別為1．56±0．36，1．69±0．32，與未轉(zhuǎn)染組0．70±0．08，0．74±0．18和轉(zhuǎn)染空載體組0．68±0．18，0．80±0．19比較，有顯著差異(p＜0．05)。 結(jié)論HBx可誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞高表達(dá)TNF-α、IL-1β和IL-6，促進系膜細(xì)胞增殖。HBx對系膜細(xì)胞的增殖作用可能與TNF-α、IL-1β、IL-6的高表達(dá)有關(guān)。 第三部分乙型肝炎病毒X蛋白通過激活核因子-κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶上調(diào)大鼠系膜細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子-α 目的探討HBV X基因轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞增殖及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)高表達(dá)的細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。方法將含有HBVX基因的質(zhì)粒pCI-neo-X轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞，MTT法檢測系膜細(xì)胞增殖，半定量RT-PCR檢測TNF-αmRNA表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α表達(dá)。Western blot檢測HBx、ERK_(1/2)及p-ERK_(1／2)表達(dá)。分別采用特異性抑制劑U0126阻斷ERK_(1/2)通路，Lactacystin阻斷NF-κB通路和SB203580阻斷p38MAPK通路，觀察培養(yǎng)細(xì)胞增殖、TNF-α及其mRNA表達(dá)，以不加抑制劑作為對照。結(jié)果轉(zhuǎn)染pCI-neo-X后，系膜細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表達(dá)均增高，通過阻斷ERK_(1／2)或NF-κB通路，系膜細(xì)胞增殖減弱，細(xì)胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表達(dá)均下降。而阻斷p38MAPK通路對系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表達(dá)無明顯影響。結(jié)論轉(zhuǎn)染HBV X基因可促使系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表達(dá)均增高，這一作用可能部分是HBV X基因表達(dá)的蛋白通過激活ERK_(1／2)以及NF-κB通路信號而實現(xiàn)。而與p38MAPK通路無關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62;R692.3
【圖文】：

叉叉叮口 !!!鬢鬢 鬢三三‘夕眾 lll圖2:pcl一neo一HBx載體構(gòu)建流程圖 T7TranseriPtionStart5’二丁幣勺幼認(rèn)CGACTCACI乎習(xí) -AGGCT戶GCCTCGAGAA耳CACGCGTGG丁 T7Promoter尹動戶}廠力0!石COR!}l八刃汀}圖3:酶切位點線性模式圖二、PCR擴增X基因用常規(guī)PCR方法擴增X基因，以HBV基因組DNA為模板，引物如下，上游引物5’一CCGCTCGAGGTATACATCATTTCCATGGC一3’下游引物5’一CCGGAATTCGAGATGATTAGGCAGAGGTG一3，分別在上游引物和下游引物5’端添加限制性內(nèi)切酶Ec口Rl和腸口I酶切位點�！�7

72℃ 10min 4OCIOhrsPCR產(chǎn)物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在50Obp處有特異性條帶。如圖4。500bP一~464bP圖4:PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳18

CI一neo一X酶切圖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a后選的基因片段后送上海英駿生基因adw亞型序列一致。比對結(jié)果:TGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGATGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGA

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2768403