【摘要】：目的乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)是HBV基因復(fù)制和合成的模板,也是抗病毒治療結(jié)束后乙型肝炎復(fù)發(fā)的主要原因。本研究旨在建立滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling Cycle Amplification,RCA)方法,檢測(cè)HBV cccDNA,研究此方法的特異性及敏感性,探索其臨床意義及應(yīng)用價(jià)值。 方法以HBV全基因質(zhì)粒為模板,經(jīng)酶切、連接、濃縮、膠回收純化等步驟,構(gòu)建和制備HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品,作為研究中的陽(yáng)性對(duì)照DNA模板。用Qiagen試劑盒抽提慢性乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本總DNA,并經(jīng)Plasmid SafeTM ATP dependent Danse(PSAD)酶處理,以此為模板,進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。用HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品、3.2Kb線性HBV DNA、正常肝組織及15例慢性乙型肝炎患者血清作為對(duì)照,分別以瓊脂糖凝膠電泳和Southern Blot印跡核酸雜交兩種方法驗(yàn)證此方法的特異性。將HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋,了解該方法的敏感性。 結(jié)果本研究成功構(gòu)建了HBV cccDNA,并可用RCA方法進(jìn)行擴(kuò)增;RCA方法可從少至2mg的慢性乙型肝炎患者的肝組織中檢測(cè)到HBV cccDNA;該方法可檢測(cè)低至102拷貝的HBV cccDNA分子;RCA方法不能檢測(cè)3.2Kb線性HBV DNA;在正常肝組織及15例乙肝患者血清中檢測(cè)不到HBV cccDNA。結(jié)論RCA方法操作較方便,具有很高的特異性和敏感性,可為肝細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA多態(tài)性的分析、研究提供基礎(chǔ),同時(shí)為臨床上慢性乙型肝炎患者治療過(guò)程中發(fā)生耐藥機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有較高的臨床意義及應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62;R440
【圖文】：

圖1 HBV cccDNA構(gòu)建(1A)及跨rcDNA缺口區(qū)PCR擴(kuò)增（1B）：圖1A中顯示了三種連接產(chǎn)物，Marker分子量標(biāo)記為2.1Kb的DNA即為HBV cccDNA為線性DNA，6.4Kb的DNA為DNA雙體。圖1B中以三種HBV DNA為模板，用跨rcDPCR擴(kuò)增，3.2Kb線性DNA無(wú)產(chǎn)物。M：Marker；1:6.4Kb線性DNA；2：3.2Kb線性D,4：H2O。2A 2Bp M 1 2 1 2 M bp0→←6000

2A 2Bbp M 1 2 1 2 M bp圖2 構(gòu)建的HBV cccDNA RCA產(chǎn)物（2A）及RCA產(chǎn)物酶切鑒定（2B）注：圖2A:以構(gòu)建的HBVcccDNA為模板滾環(huán)擴(kuò)增，均可見擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2B：將滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物單酶切，標(biāo)準(zhǔn)HBV cccDNA為模板的產(chǎn)物酶切后可見3.2KB條帶；以H2O為對(duì)照，未見有3.2KB條帶，M：Marker; 1:H2O; 2: HBVcccDNA模板6000 →3000 →2000 →← 6400← 3200← 21002000 →500 →10000→←6000←3000←2000

圖3 RCA反應(yīng)特異性分析注：RCA產(chǎn)物（3A）及RCA產(chǎn)物單酶切（3B），M: Marker, 1：HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品，2：HBV.2Kb線性DNA，3：經(jīng)PSAD酶消化的正常對(duì)照肝組織總DNA，4：經(jīng)PSAD酶消化的乙肝組織總DNA，：血清總DNA，6：H2OM 1 2 3 4 5 64.0Kb →3.2Kb →

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2766259