【摘要】：研究背景潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD),它是由多種原因引起的慢性和復(fù)發(fā)性腸道炎癥�？捎绊懘竽c和回腸,臨床表現(xiàn)為腹瀉,腹痛,大便帶粘液及膿血等,疾病反復(fù)發(fā)作多數(shù)可誘發(fā)息肉,腺瘤,甚至癌癥。結(jié)腸直腸腺瘤是從腺上皮發(fā)生的一種良性腫瘤。它們可能存在于結(jié)腸的每一腸段中,并且在直腸和乙狀結(jié)腸中更常見(jiàn),通常被分為三種類(lèi)型:管狀,絨毛和混合型,是因?yàn)閺慕M織學(xué)角度,它們有不同的形態(tài)特征,但不論哪種類(lèi)型的腺瘤均存在不典型增生并具有惡變的傾向,也因此被認(rèn)為是癌前病變。腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y的風(fēng)險(xiǎn)與其大小,數(shù)量,絨毛特征和組織分化程度密切相關(guān)[1]。結(jié)腸直腸腺瘤可以演變成結(jié)腸直腸癌(CRC)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),約80%的結(jié)腸直腸癌發(fā)生是由于結(jié)腸直腸腺瘤的發(fā)展,這個(gè)過(guò)程約需要5-10年[2]。因此,研究結(jié)直腸腺瘤發(fā)展到癌變的過(guò)程對(duì)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義。而且潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸直腸腺瘤目前在其治療中具有復(fù)發(fā)特征。從病因角度分析,引起所有消化系統(tǒng)疾病的病因中細(xì)菌往往是其中的一個(gè)。眾多的研究中,目前公認(rèn)的有:幽門(mén)螺桿菌感染是引起消化性潰瘍的重要因素;食管炎癥和腸上皮化生患者的食管粘膜菌群與健康者存在差異,因此食管炎癥和腸上皮化生的發(fā)病跟菌群變化存在關(guān)聯(lián)[3]。關(guān)于腸道菌群的研究越來(lái)越多,而且目前的研究已經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到在消化系統(tǒng)各種疾病發(fā)病機(jī)制中菌群相互作用的重要性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)功能性胃腸病的發(fā)病機(jī)制中有一條為:細(xì)菌是經(jīng)過(guò)參與到腸道微生物群的代謝過(guò)程而引起疾病,故而相互作用是發(fā)病機(jī)制中的重要因素[4]。所以,目前認(rèn)為宿主和腸道微生物群是共生的,消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生腸道微生物群參與其中,但是宿主的基因,免疫和環(huán)境因素等會(huì)影響腸道微生物群的組成,腸道微生物也會(huì)在特定條件下破壞宿主的免疫和生理功能,導(dǎo)致病理改變,引起臨床癥狀。人體內(nèi)存在復(fù)雜的細(xì)菌,其中大多數(shù)是在胃腸道中,而在胃腸道中,絕大多數(shù)細(xì)菌又集中在結(jié)腸,結(jié)腸正是潰瘍性結(jié)腸炎與息肉的最容易發(fā)病部位。人類(lèi)腸道中含有約1014個(gè)細(xì)菌微生物,這些細(xì)菌基本上以菌群(microbiota)的形式生存,共包含500-1000個(gè)不同種群[5]。據(jù)估計(jì)這些微生物的基因數(shù)量是人類(lèi)基因組基因數(shù)量的200倍[6]。不同結(jié)腸腸段的菌群含量不同,菌群組成也不同,并且腸腔和其相關(guān)聯(lián)的粘膜上微生物菌群的數(shù)量和類(lèi)型也是有差別的[7]。宿主能通過(guò)正常腸道菌群的存在得到獲益,如正常菌群可有助于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[8],起到生物拮抗作用,幫助營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用,促進(jìn)維生素生物合成,保護(hù)粘膜[9]以及抗衰老作用。因此,保持正常菌群的合理存在有助于維持健康。菌群失調(diào)(dysbacteriosis),也就是腸道菌群紊亂,可能會(huì)導(dǎo)致或加重炎癥,是因?yàn)橐坏l件允許某些過(guò)路菌或條件致病菌明顯增多成為有害細(xì)菌,打破了菌群平衡。研究還發(fā)現(xiàn),諸如抗生素相關(guān)性腹瀉[10],炎癥性腸病[11-12],自閉癥[13],肥胖[14]和腸易激綜合征[15]等疾病都與菌群失調(diào)有關(guān)。從動(dòng)力學(xué)角度,宿主的生理狀態(tài)會(huì)嚴(yán)重影響腸道微生物菌群[16]。人類(lèi)結(jié)直腸中大約存在著1014個(gè)細(xì)菌,如此龐大集體中的每個(gè)細(xì)菌必須為能從食物以及粘蛋白得到有限能量資源而展開(kāi)激烈競(jìng)爭(zhēng)[17]。腸道微生物菌群與宿主的生理狀態(tài)在正常情況下保持著平衡。腸道上皮的杯狀細(xì)胞分泌粘蛋白多糖供養(yǎng)粘膜相關(guān)菌群,杯狀細(xì)胞分泌產(chǎn)生的粘液量和組成的不同又取決于腸道菌群的局部信號(hào)以及腸道菌群本身[18]。腸道菌群可以為宿主提供有益的營(yíng)養(yǎng)性信號(hào),也可能提供不利的信號(hào),成為疾病的危險(xiǎn)因素,因此腸道菌群及其形成的多樣性和復(fù)雜性影響著腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病狀態(tài)[19]。如果宿主的粘膜生理狀態(tài)發(fā)生了變化,如炎性改變,會(huì)產(chǎn)生一些作為額外電位受體的氧化產(chǎn)物,引起兼性厭氧菌的數(shù)量明顯增加[20]。所以,宿主生理狀態(tài)的改變可引起腸道菌群的紊亂,兩者交互作用,進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)病理改變。也就是腸道菌群與宿主之間的平衡一旦打破,菌群會(huì)通過(guò)能量吸收、內(nèi)毒素血癥、腦腸軸等多種途徑影響宿主健康[21]。在潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)直腸腺瘤時(shí)杯狀細(xì)胞的密度和功能通常都會(huì)降低,腸道菌群會(huì)出現(xiàn)改變,但目前粘膜菌群改變與何種因素相關(guān)的詳細(xì)研究仍然較少,需要進(jìn)一步探索。近年以來(lái),隨著對(duì)腸道菌群越來(lái)越重視,關(guān)于菌群的文獻(xiàn)資料數(shù)量也快速增長(zhǎng),這些研究主要基于16S rDNA序列分析[22],16S rDNA即核糖體16s小亞基基因(16S ribosomal subunit gene)。16S rDNA的堿基序列包含交錯(cuò)排列的可變區(qū)和保守區(qū),保守區(qū)因其能夠在進(jìn)化過(guò)程中保持穩(wěn)定,被用來(lái)設(shè)計(jì)細(xì)菌通用物;而可變區(qū)的差異可用來(lái)區(qū)分不同的細(xì)菌[23]。具體操作方法為收集腸粘膜或糞便樣本,然后從中提取細(xì)菌的16S rDNA基因片段,按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序,利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得其序列信息,然后比對(duì)16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù),在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上對(duì)該序列進(jìn)行定位[24],以確定細(xì)菌的類(lèi)型。高通量測(cè)序技術(shù)以其一次可并行大量測(cè)序及讀長(zhǎng)較短等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用,方法有很多,目前常用的包括:大規(guī)模平行簽名測(cè)序法、聚合酶克隆法以及454焦磷酸測(cè)序法、MiSeq測(cè)序等。我們將利用454焦磷酸測(cè)序方法和MiSeq測(cè)序方法對(duì)腸粘膜內(nèi)菌群進(jìn)行研究分析。此外,腸道菌群具有潛在的診斷價(jià)值。Belcheva等[27]通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌微生物及其代謝標(biāo)志物可用于疾病的預(yù)測(cè)。Baxter等[28]對(duì)490例結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤病人和正常對(duì)照的糞便樣本利用16S rRNA基因測(cè)序的方法進(jìn)行分析,構(gòu)建隨機(jī)森林模型,進(jìn)而驗(yàn)證模型的效能,發(fā)現(xiàn)其診斷效能優(yōu)異,受試者工作特征曲線(xiàn)下面積(Area under curve,AUC)為0.847。同課題組研究人員采用同樣的方法對(duì)404名結(jié)直腸癌病人糞便標(biāo)本研究,構(gòu)建診斷模型,AUC為0.853[29]。Zeller等[30]對(duì)156名參與者的糞便樣本利用宏基因組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析,構(gòu)建診斷模型,AUC為0.84。在本研究中我們將基于腸粘膜菌群的分析,利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法建立模型預(yù)測(cè)結(jié)直腸腺瘤,以探討腸粘膜菌群的診斷價(jià)值。近年來(lái)機(jī)器學(xué)習(xí)方法逐漸被應(yīng)用于臨床診斷。機(jī)器學(xué)習(xí)方法就是一個(gè)從樣例歸結(jié)到計(jì)算機(jī)程序的過(guò)程,它具有強(qiáng)大的學(xué)習(xí)能力和推廣能力,學(xué)習(xí)能力為利用已知數(shù)據(jù)和知識(shí)從而發(fā)現(xiàn)規(guī)律。推廣能力為通過(guò)學(xué)習(xí)發(fā)現(xiàn)的規(guī)律不但能解釋已知數(shù)據(jù)和知識(shí),還能對(duì)未知數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)念A(yù)測(cè)和判斷。它的操作過(guò)程為掌握已知數(shù)據(jù),然后通過(guò)設(shè)計(jì)算法以及模型進(jìn)行學(xué)習(xí),發(fā)現(xiàn)內(nèi)在的聯(lián)系,進(jìn)而對(duì)未知的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)和判斷。支持向量機(jī)(Support Vector Machine,SVM)[31]是機(jī)器學(xué)習(xí)方法中的一種算法,它的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在:小樣本研究、非線(xiàn)性以及高維模式識(shí)別。SVM能夠通過(guò)對(duì)有限的樣本信息進(jìn)行分析獲得最大的推廣能力。參數(shù)選擇主要有三種方法:經(jīng)驗(yàn)法[32-33];實(shí)驗(yàn)法,主要有交叉驗(yàn)證法[34];理論法,主要指基于函數(shù)集VC維的算法[35]。目前能否應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)通過(guò)粘膜菌群的組成來(lái)判斷病變類(lèi)型尚無(wú)研究。我們首次采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法中的支持向量機(jī)算法判別腺瘤與非腺瘤病灶,并比較兩者準(zhǔn)確率與魯棒性。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(Confocallaserendomicroscopy,CLE)的原理是把共聚焦激光顯微鏡與傳統(tǒng)消化內(nèi)鏡融合在一起,采集到的圖像可以放大至1000倍。使用熒光素鈉作為造影劑可以在傳統(tǒng)內(nèi)窺鏡檢查過(guò)程中對(duì)消化道粘膜進(jìn)行實(shí)時(shí)“光學(xué)活檢”,以準(zhǔn)確快捷地得到可以與組織活檢媲美的圖像。目前,新型共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡已經(jīng)發(fā)展成探針類(lèi)型。它可以靈活地插入常見(jiàn)的消化道內(nèi)窺鏡活檢通道,收集腸粘膜的實(shí)時(shí)圖像。在探頭移動(dòng)期間,能夠清晰地觀(guān)察到一定深度的組織和細(xì)胞。所以,CLE檢查時(shí)不僅能夠獲得組織的圖像,還能夠觀(guān)察粘膜上皮的生理病理狀態(tài)。CLE可用各種指標(biāo)來(lái)評(píng)估腸黏膜的病理生理狀態(tài),如:上皮完整性[36-37],新血管生成[38-39]和炎性滲出[40]等。在CLE下潰瘍性結(jié)腸炎的特征可能表現(xiàn)為:隱窩的不規(guī)則排列,隱窩大小和數(shù)量的變化,隱窩融合,熒光素滲出和隱窩膿腫等。不同分期的特征會(huì)有所不同。多項(xiàng)與病理學(xué)對(duì)照的研究發(fā)現(xiàn)共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎炎癥活動(dòng)度的診斷準(zhǔn)確性、可行性均較高[40-42],其中Li等發(fā)現(xiàn)CLE可以準(zhǔn)確判斷UC的炎癥活動(dòng)程度;隱窩結(jié)構(gòu)、微血管改變和熒光素滲漏是CLE下判斷UC炎癥活動(dòng)程度的主要依據(jù)[40]。在CLE下,結(jié)腸直腸腺瘤主要呈現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上改變,包括不規(guī)則或絨毛狀隱窩,改變了的隱窩/間質(zhì)比例,隱窩被破壞,血管形態(tài)(包括直徑,數(shù)量,形態(tài)等)的變化以及熒光素滲出等,其次還有細(xì)胞的變化,包括上皮細(xì)胞異型,細(xì)胞極性變化,杯狀細(xì)胞減少甚至消失等。Kiesslich等人[43]觀(guān)察結(jié)腸鏡檢查患者,如果在過(guò)程中發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉,則進(jìn)一步行CLE檢查,并根據(jù)上皮細(xì)胞形態(tài),血管結(jié)構(gòu)和隱窩類(lèi)型對(duì)CLE圖像進(jìn)行前瞻性評(píng)估,對(duì)結(jié)腸息肉取活檢,將CLE圖像與病理圖像比對(duì)。研究發(fā)現(xiàn)CLE圖像和活檢標(biāo)本的病理結(jié)果存在高度一致性,而且靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確性都很高,因此,CLE能夠用來(lái)預(yù)測(cè)新生物。同課題組進(jìn)一步研究將5580幅共聚焦圖像與組織病理學(xué)結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)共聚焦預(yù)測(cè)瘤變的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為94.7%、98.3%和97.8%[44]。所以,在CLE下可以很容易地判斷UC的炎癥活動(dòng)程度和結(jié)直腸腺瘤的類(lèi)型,也就是粘膜的病理生理狀態(tài),從而做出內(nèi)鏡診斷。另外,CLE的主要優(yōu)勢(shì)之一還表現(xiàn)在體內(nèi)評(píng)估和非侵入性。因此,CLE可用于鑒定目標(biāo)粘膜,靶向活檢,進(jìn)而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序和分析。在這項(xiàng)研究中,我們利用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸直腸腺瘤做出診斷。靶向獲取病變部位粘膜,同時(shí)從正常部位粘膜取標(biāo)本作為對(duì)照,利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)收集的粘膜菌群16S rDNA基因序列進(jìn)行提取,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行物種注釋,對(duì)腸粘膜菌群進(jìn)行差異性分析,構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),并探討腸粘膜菌群的診斷價(jià)值。目的本研究旨在就不同疾病狀態(tài)和不同活檢部位的腸粘膜菌群組成進(jìn)行差異性分析,并探討腸粘膜內(nèi)菌群的診斷價(jià)值。方法本研究的研究對(duì)象選擇是2013年11月至2017年7月期間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院做高清結(jié)腸鏡檢查的患者。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的受試者按常規(guī)使用高分辨率白光內(nèi)鏡進(jìn)行檢查,在檢測(cè)到病灶后,進(jìn)一步行pCLE檢查。病變部位和相鄰的正常對(duì)照部位均采用相同的方法檢查,并于內(nèi)鏡下進(jìn)行診斷。將診斷的病變和正常粘膜取活檢,并且使用標(biāo)準(zhǔn)清洗方法以除掉粘膜表面上附著的細(xì)菌及糞便,標(biāo)本被冷凍保存。按批次將粘膜標(biāo)本的細(xì)菌DNA使用16S rDNA高通量測(cè)序方法測(cè)序。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)返回后做基本處理,再采用mothur軟件分析,聚類(lèi)0TU,進(jìn)行物種注釋,按照取材部位和共聚焦內(nèi)鏡下的診斷類(lèi)型比較腸粘膜菌群間的整體差異,構(gòu)建16s rDNA的進(jìn)化關(guān)系,利用SVM方法判別腺瘤與非腺瘤病變,驗(yàn)證腸粘膜菌群16s rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)是否有診斷價(jià)值。結(jié)果在這項(xiàng)研究中,共篩查了 771名患者,并將其中的78名患者納入研究組進(jìn)行最終數(shù)據(jù)分析。粘膜菌群經(jīng)高通量測(cè)序并處理后得到1,992,098條有效序列。按照0.97相似性聚類(lèi)得到8,151個(gè)0TU,并進(jìn)行物種注釋。對(duì)粘膜菌群的差異性分析表明腸粘膜活檢部位和病變類(lèi)型均能影響腸粘膜菌群的組成,且活檢部位的影響更大。構(gòu)建出腸粘膜菌群16s rDNA基因的整體進(jìn)化關(guān)系圖,該圖顯示了菌群之間的進(jìn)化關(guān)系。每一個(gè)小分支是一個(gè)OTU的代表性序列,越靠近末端表示相鄰之間關(guān)系越近。腸粘膜菌群16s rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)具有潛在的診斷價(jià)值。結(jié)論共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一個(gè)有用的工具,可用于評(píng)估人類(lèi)在體粘膜的病理生理狀態(tài),有助于疾病早期診斷,方便靶向活檢。腸粘膜活檢部位和病變類(lèi)型均能影響腸粘膜菌群的組成。腸粘膜菌群16s rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)具有潛在的診斷價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R574.62
【圖文】：

采用距離依靠法計(jì)算兩兩序列間的差異，構(gòu)建腸粘膜菌群１６ｓ邋ｒＤＮＡ基因的整體逡逑進(jìn)化關(guān)系，并以ＦｉｇＴｒｅｅ軟件（Ｖｅｒｓｉｏｎ邋１．４．２）進(jìn)行可視化繪圖，分別以鐘形圖和逡逑樹(shù)形圖表示，見(jiàn)圖４。該系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)展現(xiàn)了所得到的物種之間的關(guān)系，每條終端逡逑線(xiàn)段代表一個(gè)獨(dú)特序列，擁有各自的物種名稱(chēng)，因其過(guò)于龐大，且在該研究中未逡逑對(duì)具體菌種展開(kāi)分析，因此在繪制進(jìn)化樹(shù)時(shí)將菌種名稱(chēng)省去。線(xiàn)段長(zhǎng)度代表與鄰逡逑近序列間的差異。越靠近末端表示相鄰之間的進(jìn)化關(guān)系越近。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的建立逡逑有利于進(jìn)行序列同源性分析，方便研究未知菌種與其他菌種的親緣關(guān)系。逡逑圖４構(gòu)建腸粘膜菌群１６ｓ邋ｒＤＮＡ基因的整體進(jìn)化關(guān)系。分別以鐘形圖（左）和樹(shù)逡逑２８逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2766145