【摘要】：【背景】 肝硬化是由各種慢性肝臟損害所導(dǎo)致的肝臟疾病晚期階段。對于失代償期肝硬化，內(nèi)科常規(guī)的保肝和對癥治療不能延長患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治療手段，但受供肝缺乏、費(fèi)用高昂等因素的嚴(yán)重限制。近年來，隨著干細(xì)胞相關(guān)研究的不斷深入，自體骨髓源干細(xì)胞（Bone marrow-derived stem cells, BMSCs）用于人類多種疾病的治療取得了重要進(jìn)展。越來越多的臨床探索性研究發(fā)現(xiàn)，自體BMSCs移植能有效地提升失代償期肝硬化患者的肝功能。有關(guān)干細(xì)胞促進(jìn)肝功能恢復(fù)的機(jī)理，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，除了轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞或與內(nèi)源肝細(xì)胞融合外，干細(xì)胞主要通過調(diào)控機(jī)體免疫狀態(tài)或肝臟免疫微環(huán)境而發(fā)揮作用。然而，自體BMSCs移植使機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生了什么樣的變化仍未見報(bào)道。 本課題組前期進(jìn)行了自體干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化的臨床探索性研究。我們利用粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）將BMSCs動(dòng)員到外周血中，再從外周血中分離出干細(xì)胞，最后將獲得的干細(xì)胞通過血管介入回輸至患者肝動(dòng)脈。針對失代償期肝硬化患者的臨床隨機(jī)對照研究表明，與僅接受G-SCF處理的患者相比，接受自體干細(xì)胞移植的患者肝功能顯著提高。至2012年12月，我們對416例失代償期肝硬化患者進(jìn)行了自體干細(xì)胞移植治療，隨訪結(jié)果表明，干細(xì)胞治療顯著提高了患者的3年生存率（87%，對照組為29%）。我們對42例接受干細(xì)胞移植治療的患者進(jìn)行了免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在干細(xì)胞治療后第1、3、6、9、12月，患者外周血IL-17水平呈持續(xù)下降趨勢，并與患者肝功能指標(biāo)的變化呈正相關(guān)。提示IL-17可能與BMSCs促進(jìn)肝功能恢復(fù)有關(guān)。 本研究將采用四氯化碳（Carbon tetrachloride, CCl_4）制備小鼠肝損傷模型，并對肝損傷小鼠進(jìn)行同源BMSCs移植治療。利用這一模型，探討IL-17在CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷和BMSCs改善肝損傷過程中的作用，為闡明BMSCs促進(jìn)肝病患者肝功能恢復(fù)的機(jī)理提供理論依據(jù)。 【目的】 1.明確IL-17在CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷中的作用； 2.闡明IL-17在BMSCs促進(jìn)小鼠肝損傷修復(fù)中的作用。 【方法】 1.采用CCl_4腹腔注射誘導(dǎo)小鼠肝損傷。在肝損傷誘導(dǎo)過程中，HE和天狼星紅染色檢測小鼠肝臟炎癥和纖維化程度，血漿生化檢測丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase, ALT）、白蛋白（albumin, ALB），同時(shí)采用ELISA檢測小鼠外周血IL-17水平，Real-time PCR檢測小鼠肝組織表達(dá)促炎因子IL-6、IL-8、TNF-、IFN-γ、IL-17A、IL-17F以及IL-17RA和IL-17RC的水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝內(nèi)單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞的百分比； 2.給予特異性抗小鼠IL-17抗體（Anti-IL-17mAb）或重組小鼠（Rm）IL-17干預(yù)CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷過程，HE和天狼星紅染色檢測小鼠肝臟炎癥和纖維化程度，血漿生化檢測ALT、ALB，Real-time PCR檢測肝纖維化相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶3（Matrix metalloproteinase3, MMP3）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（Tissueinhibitor of metalloproteinase1, TIMP1）和TGF-β1的表達(dá)，免疫組化、Real-time PCR和Western blot檢測肝組織表達(dá)-SMA的情況； 3.將同品系小鼠BMSCs經(jīng)尾靜脈移植給CCl_4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠（5×106BMSCs/只），采用ELISA檢測小鼠外周血IL-17水平，Real-time PCR檢測小鼠肝組織IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC及IL-23p19的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝內(nèi)單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞的百分比； 4.給予Anti-IL-17mAb和RmIL-17因子干預(yù)BMSCs治療CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的過程，HE和天狼星紅染色檢測肝組織炎癥和纖維化程度，Real-time PCR檢測肝內(nèi)膠原層蛋白collagen-1的表達(dá)，血清生化檢測小鼠肝功能（ALT和ALB水平）。【結(jié)果】 1. IL-17與小鼠肝損傷過程密切相關(guān) HE、天狼星紅染色和血清生化檢測結(jié)果顯示，連續(xù)6周CCl_4腹腔注射成功誘導(dǎo)出小鼠肝損傷模型，表現(xiàn)為肝組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤、纖維化形成，外周血ALT升高而ALB水平顯著降低。ELISA、Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在CCl_4誘導(dǎo)肝損傷過程中，外周血IL-17水平和肝組織內(nèi)IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-的表達(dá)水平逐漸升高，而肝組織內(nèi)Th17細(xì)胞百分比和IFN-γ的表達(dá)水平無明顯變化。當(dāng)撤除CCl_4后，小鼠肝損傷逐漸恢復(fù)，外周血IL-17水平和肝組織內(nèi)IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-的表達(dá)水平也逐漸恢復(fù)至幾乎正常。 2. IL-17促進(jìn)CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷 在用CCl_4制備小鼠肝損傷過程中，和僅給予CCl_4腹腔注射組相比，聯(lián)合注射RmIL-17能顯著加重小鼠肝損傷，而聯(lián)合注射Anti-IL-17mAb卻顯著減輕CCl_4誘導(dǎo)的肝損傷。Real-time PCR、免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，與單純使用CCl_4相比，聯(lián)合使用CCl_4和RmIL-17顯著增加了肝組織內(nèi)MMP3、TIMP1、TGF-β1、-SMA的表達(dá)，而聯(lián)合使用CCl_4和Anti-IL-17mAb卻抑制了MMP3、TIMP1、TGF-β1、-SMA的表達(dá)。 3.同源BMSCs下調(diào)小鼠IL-17表達(dá)水平 同源BMSCs移植治療能有效改善CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。在BMSCs促進(jìn)肝損傷恢復(fù)的同時(shí)，小鼠外周血IL-17水平也明顯下降，逐漸恢復(fù)至幾乎正常水平；肝組織內(nèi)IL-23p19、IL-17A、IL-17F、IL-17RA和IL-17RC的表達(dá)也顯著下降；但是肝內(nèi)Th17細(xì)胞百分比無明顯變化。 4. IL-17在BMSCs促進(jìn)CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷修復(fù)過程中起重要作用 在BMSCs移植治療CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷過程中，加入外源性RmIL-17顯著減弱了BMSCs的治療效果。與BMSCs治療組相比，BMSCs聯(lián)合RmIL-17組小鼠的肝組織炎癥和纖維化顯著加重。采用Anti-IL-17mAb對肝損傷小鼠治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能顯著減輕肝組織炎癥和纖維化程度，且與BMSCs移植治療組無明顯差異。 【結(jié)論】 本研究表明，IL-17參與了CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的病理過程，BMSCs可能通過下調(diào)IL-17發(fā)揮促進(jìn)小鼠肝損傷恢復(fù)的作用。BMSCs下調(diào)IL-17和IL-17促進(jìn)肝損傷的機(jī)制值得下一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2
【圖文】：

圖 1. 骨髓源干細(xì)胞亞群及其在肝損傷中的可能作用[25]那么，混合的 BMSCs 治療效果是否優(yōu)于單一類型的干細(xì)胞？目前尚不清楚。大量的臨床研究采用混合 BMSCs 治療肝臟疾病，研究表明移植的 BMSCs 能有效改善患者肝功能[90-92]。在臨床研究中，我們采用 G-CSF 將失代償期肝硬化患者的 BMSCs 動(dòng)員至外周血，再分離、采集骨髓干細(xì)胞，之后應(yīng)用血管介入方法將采集的干細(xì)胞經(jīng)肝動(dòng)脈回輸至患者肝臟，并對患者進(jìn)行隨訪。至 2012 年 12 月，我們對 416 例失代償期肝硬化患者進(jìn)行了自體干細(xì)胞移植治療，隨訪結(jié)果表明，干細(xì)胞治療顯著提高了患者的3 年生存率（87%，對照組為 29%）。目前關(guān)于 BMSCs 對失代償期肝硬化患者的免疫調(diào)節(jié)作用尚無報(bào)道。我們觀察了 42 例失代償期肝硬化患者接受自體 BMSCs 治療前后的免疫指標(biāo)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在干細(xì)胞治療后隨訪的第 1、3、6、9、12月，患者外周血 IL-17 水平呈持續(xù)下降趨勢（圖 2），并且其下降趨勢與肝功能恢復(fù)密切相關(guān)（圖 3）。因此我們推測：BMSCs 可能通過下調(diào)患者體內(nèi) IL-17 水平促進(jìn)

失代償期肝硬化患者經(jīng)干細(xì)胞移植后外周血 IL-17 變動(dòng)員前基線（Baseline）、動(dòng)員后、移植術(shù)后 1、3、6、9-17 水平。*p<0.05、**p<0.01 干細(xì)胞移植后與動(dòng)員前基化患者與正常對照組相比。

檢測外周血 IL-17 水平。*p<0.05、**p<0.01 干細(xì)胞移植后與動(dòng)員前基線相比，§p<0.05失代償期肝硬化患者與正常對照組相比。圖3. 失代償期肝硬化患者經(jīng)干細(xì)胞移植后肝功能改善和IL-17變化趨勢虛線為正常低限值

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 唐永明;梁立敏;余建華;胡峻;;檢測IL-17和IL-18水平在纖維增生性疾病中的意義[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2007年02期

2 趙志海,辛紹杰,趙景民,王松山,劉平,尹鐵勇,周光德;MMP-2、MT-MMP-2在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化形成和逆轉(zhuǎn)過程中表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2004年04期

本文編號：2763509