【摘要】： 肝功能衰竭是各種嚴重肝病的終末期表現(xiàn),肝移植是肝功能衰竭治療的最有效手段,但供肝來源的緊缺限制了肝移植的廣泛使用。以培養(yǎng)肝細胞為材料的體外生物人工肝支持系統(tǒng)有望為肝功能衰竭患者等待肝移植或通過自身肝再生恢復(fù)提供過渡的“橋梁”。迄今為止,幾種新型的生物人工肝已進入Ⅱ～Ⅲ期臨床試驗,并取得了令人鼓舞的結(jié)果。生物人工肝的三大要素是生物反應(yīng)器、肝細胞和體外裝置,其中,生物反應(yīng)器是生物人工肝的核心部分,其性能直接關(guān)系到生物人工肝支持治療的效果和作用。故生物反應(yīng)器的設(shè)計和構(gòu)建在生物人工肝研究與臨床應(yīng)用中具有重要的意義。 隨著生物人工肝研究的不斷深入,圍繞著為肝細胞提供良好的生長、代謝環(huán)境和為肝功能衰竭患者血液或血漿與肝細胞相互作用、進行物質(zhì)交換提供理想的場所兩大基本功能,在傳統(tǒng)中空纖維型生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上,一些新的生物反應(yīng)器不斷出現(xiàn),歸納起來主要為四大類:中空纖維型、灌流式/支架型、細胞包裹/懸液型、平板式生物反應(yīng)器。其中中空纖維型生物反應(yīng)器具有較強的免疫阻隔和物質(zhì)傳輸作用,但肝細胞培養(yǎng)效果較差,灌流式/支架型生物反應(yīng)器具備良好的肝細胞培養(yǎng)效果,而缺乏免疫阻隔和灌流不均。如果能夠?qū)⒐嗔魇?支架型與中空纖維型生物反應(yīng)器有效結(jié)合,可揚長避短,這種雜交型生物反應(yīng)器尚未見研究報道。本實驗設(shè)計和構(gòu)建雜交型生物反應(yīng)器,力求實現(xiàn)肝細胞培養(yǎng)、物質(zhì)傳輸、免疫阻隔三者的完美結(jié)合,提高生物反應(yīng)器的性能和肝支持效果,為生物人工肝治療肝功能衰竭提供新的實驗依據(jù)。 本實驗選擇有代表性的6種半透膜材料進行肝細胞(L02細胞)培養(yǎng),通過檢測細胞LDH漏出量和DNA Ladder細胞凋亡評價膜材料的細胞毒性,觀察各種膜材料上L02細胞的貼壁率、細胞活性、DNA總量、總蛋白合成和CYP1A2活性等,篩選出肝細胞相容性最佳的半透膜材料用于中空纖維制備。 利用非對稱性冷卻成型技術(shù)制備單內(nèi)皮層PES平板膜和中空纖維,采用多種顯微鏡觀察制備的平板膜和中空纖維結(jié)構(gòu),著重分析L02細胞在PES平板膜和中空纖維上的形態(tài)、生長曲線、白蛋白合成、LDL攝取、生物轉(zhuǎn)化等功能,以評價制備的PES平板膜和中空纖維對肝細胞粘附、生長、增殖和功能表達的支持效果。 應(yīng)用一步發(fā)泡技術(shù)制備聚氨酯多孔支架材料,并與商品化的殼聚糖、聚乳酸-聚羥乙酸酯三維支架材料對比,根據(jù)材料的肝細胞相容性、孔隙率、孔徑、和物理特性等,確定用于生物反應(yīng)器構(gòu)建的三維支架材料,在此基礎(chǔ)上,進一步采用鼠尾膠原或纖維蛋白凝膠進行優(yōu)化培養(yǎng),以提高該支架材料對肝細胞培養(yǎng)的支持效果。 在上述研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建PES中空纖維和聚氨酯多孔支架雜交的三維立體式生物反應(yīng)器。利用血漿循環(huán)評價該反應(yīng)器的物質(zhì)傳輸能力;通過纖維蛋白凝膠進行反應(yīng)器內(nèi)肝細胞的凝膠化培養(yǎng),觀察反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)肝細胞的形態(tài)和分布,檢測凝膠化反應(yīng)器內(nèi)肝細胞功能的表達,以評價反應(yīng)器的性能;采用體外人工肝實驗評價生物反應(yīng)器對重型肝炎病人血漿的肝支持作用。 本實驗的主要研究結(jié)果如下: 1.在各種膜材料上培養(yǎng)L02細胞的LDH漏出量與對照組無顯著差異,提取的細胞DNA電泳未見DNA Ladder。細胞在PES膜上的貼壁率顯著高于CA、PVDF、PP、CNA膜,與對照組和PSF膜無顯著差異,PSF膜顯著低于對照組;PES膜上貼壁細胞數(shù)明顯較CA和CNA膜多,形態(tài)典型。PES和PSF膜上細胞DNA總量與對照組無顯著差異,顯著高于CA、PP、CNA膜,PVDF膜上細胞DNA總量顯著低于對照組;在7天的培養(yǎng)時間內(nèi),PES膜上和對照組的細胞活性最高,顯著高于CA、PVDF、PP、CNA膜。PES膜上培養(yǎng)L02細胞合成的細胞總蛋白與對照組無顯著差異,顯著高于其它膜材料;各種膜材料上培養(yǎng)L02細胞CYP1A2活性均高于對照組。 2.制備的PES平板膜和中空纖維的橫截面由大量縱向排列的指狀孔構(gòu)成,指狀孔開口于外表面形成有大量微孔的粗糙面,封閉于的內(nèi)表面形成致密層和光滑面。PES膜上L02細胞的生長曲線典型,在8d的培養(yǎng)時間能增殖6至7倍,中空纖維上培養(yǎng)的L02細胞可長滿中空纖維表面;細胞在PES膜和中空纖維上粘附呈多細胞聚集生長,可覆蓋材料表面,部分細胞延伸入表面微孔內(nèi)。PES膜和中空纖維上培養(yǎng)細胞LDH漏出量與對照無顯著差異。PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細胞的白蛋白合成量持續(xù)升高,在第8天反超對照組細胞;在DiI-Ac-LDL攝取實驗中,PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細胞內(nèi)紅色熒光強度與對照無明顯差異,在戊醚試鹵靈轉(zhuǎn)化實驗中,PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細胞內(nèi)紅色熒光強度比對照組高。 3.制備出高孔隙率和有彈性的聚氨酯多孔支架材料,殼聚糖易塌陷變形,聚乳酸-聚羥乙酸酯質(zhì)地較硬,提示聚氨酯更容易與中空纖維組合。L02細胞在聚氨酯和殼聚糖支架材料內(nèi)的細胞接種率顯著高于聚乳酸-聚羥乙酸酯,殼聚糖內(nèi)的細胞接種率最高;L02細胞在聚氨酯和聚乳酸-聚羥乙酸酯內(nèi)均粘附微孔壁生長,在聚氨酯內(nèi)分布更均勻,在殼聚糖內(nèi)呈多細胞聚集生長;聚氨酯和殼聚糖內(nèi)培養(yǎng)L02細胞的活性和白蛋白合成量顯著高于聚乳酸-聚羥乙酸酯,聚氨酯和殼聚糖之間無顯著差異。鼠尾膠原被覆組和對照組的L02細胞均在聚氨酯材料微孔內(nèi)貼壁生長,鼠尾膠原被覆組的貼壁細胞數(shù)量明顯高于聚氨酯對照組,纖維蛋白凝膠組培養(yǎng)的L02細胞均勻分布在材料微孔內(nèi),呈多細胞球形體生長;纖維蛋白凝膠組L02細胞的活性在7d內(nèi)顯著升高,在3、5、7d均顯著高于聚氨酯對照組和纖維蛋白凝膠組;纖維蛋白凝膠組L02細胞的白蛋白合成量逐漸升高,在培養(yǎng)的第5和7d顯著高于鼠尾膠原被覆組和聚氨酯對照組。 4.以單內(nèi)皮層PES中空纖維和聚氨酯材料為骨架構(gòu)建出雜交型三維立體式生物反應(yīng)器。在物質(zhì)傳輸實驗中,雜交型生物反應(yīng)器內(nèi)外腔總膽紅素和白蛋白濃度達到平衡分別需10min和15min,與對照組無明顯差異,凝膠化雜交型反應(yīng)器內(nèi)總膽紅素和白蛋白濃度達到平衡較對照組延緩5min,但30min內(nèi)能完全達到平衡,提示構(gòu)建的反應(yīng)器具有良好的物質(zhì)傳輸能力,凝膠化對反應(yīng)器物質(zhì)傳輸?shù)臒o顯著影響。凝膠化培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)肝細胞呈球形體生長,較對照組分布更均勻;反應(yīng)器凝膠化培養(yǎng)可恢復(fù)肝細胞CYP3A4和UGT1A mRNA的表達;凝膠化反應(yīng)器內(nèi)肝細胞的白蛋白合成、尿素合成、氨清除率均持續(xù)穩(wěn)定上升,在培養(yǎng)后期顯著高于對照組,LDH漏出量較對照組更低,有較強的CYP1A2活性;凝膠化反應(yīng)器內(nèi)重型肝炎病人血漿循環(huán)實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)6h的體外循環(huán),病人血漿中總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總膽汁酸、氨等的含量均顯著降低。在循環(huán)病人血漿中ALT、ALP、GGT等酶無顯著影響,但AST和LDH持續(xù)升高。 以上結(jié)果提示:①在PES、PSF、CA、PVDF、PP、CNA等半透膜材料中,PES是肝細胞相容性最佳的半透膜材料,適宜用于生物反應(yīng)器中空纖維的制備。②制備的PES平板膜和中空纖維具備單內(nèi)皮層、指狀孔、外表面粗糙、內(nèi)表面光滑、非對稱性的特點,能夠較好的支持肝細胞的粘附、生長、增殖和功能的表達。③制備出高孔隙率有彈性的聚氨酯支架材料,與肝細胞有較好的細胞相容性,纖維蛋白凝膠能有效優(yōu)化聚氨酯材料內(nèi)肝細胞培養(yǎng)條件,提高培養(yǎng)肝細胞活性和功能的穩(wěn)定表達。④成功的構(gòu)建出雜交型三維立體式生物反應(yīng)器,該反應(yīng)器具有良好的物質(zhì)傳輸能力,凝膠化生物反應(yīng)器能夠培養(yǎng)大量、高密度、合成功能和生物轉(zhuǎn)化功能穩(wěn)定的肝細胞,該反應(yīng)器能有效清除重型肝炎病人血漿內(nèi)膽紅素、氨、膽汁酸等。據(jù)此推測,該生物反應(yīng)器有可能對重型肝炎患者的治療具備一定的肝支持效果。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R575.3;R318.0

【共引文獻】

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本文編號：2760984