【摘要】：目的:膽囊結(jié)石是嚴(yán)重影響人們健康和生活質(zhì)量的疾病。由于飲食結(jié)構(gòu)的改變,膽囊結(jié)石的發(fā)病率明顯升高。盡管膽石成因的研究有了較大進(jìn)展,但其形成機(jī)制仍不十分明了。國內(nèi)外學(xué)者對此進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)膽囊濃縮功能增強(qiáng),膽汁中膽固醇、鈣離子及粘蛋白等促成石成份濃度增高是結(jié)石形成的重要誘因。然而,膽囊本身作為與疾病發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系的器官,其重要性并未引起足夠的重視。膽囊是儲存和濃縮膽汁的器官,其粘膜有很強(qiáng)的濃縮功能。膽囊膽汁的濃縮過程主要通過離子與水的吸收來實現(xiàn),在此過程中Na+/H+交換蛋白3(Na+/H+exchanger isoform 3,NHE3)起著重要的作用。NHE是表達(dá)于粘膜上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運蛋白,其功能是將細(xì)胞外的Na+轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)同時排出等量的H+,在調(diào)節(jié)水電解質(zhì)和酸堿平衡中發(fā)揮重要作用。在膽囊上皮細(xì)胞,NHE3向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運Na+形成細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓梯度,水分子則順滲透壓梯度進(jìn)入細(xì)胞使膽囊內(nèi)膽汁濃縮。來自Narins的一項重要研究結(jié)果表明,膽囊結(jié)石形成前期膽囊粘膜濃縮增強(qiáng),NHE3的活性增高,而采用NHE3抑制劑amiloride則可以明顯抑制粘膜吸收并降低結(jié)石形成率。該研究提示,NHE3功能增強(qiáng)導(dǎo)致膽囊濃縮增加是結(jié)石形成的重要誘因。但令人遺憾的是,膽囊上皮細(xì)胞NHE3活性調(diào)節(jié)機(jī)制及其功能失調(diào)在結(jié)石形成中的作用尚屬未知。我們在以往研究基礎(chǔ)上提出致石飲食導(dǎo)致的NHE3功能異常是膽囊濃縮功能增強(qiáng)的重要誘因。因此,本博士論文擬對膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中NHE3功能失調(diào)的分子機(jī)制展開研究。研究方法:本研究以高膽固醇飲食構(gòu)建C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型。采用RT-PCR檢測正常飲食組以及致石組膽囊粘膜NHE3基因在轉(zhuǎn)錄水平的差異;采用Western blot檢測兩組膽囊粘膜NHE3蛋白的表達(dá)情況;采用免疫熒光檢測膽囊組織中NHE3細(xì)胞內(nèi)定位情況。為進(jìn)一步研究膽固醇結(jié)石形成后NHE3活性失調(diào)的機(jī)制,我們采用Western blot檢測兩組膽囊粘膜PKCα、NHERF1以及ezrin蛋白的表達(dá)情況;采用免疫共沉淀檢測NHE3與ezrin以及NHERF1的相互作用情況。為探索膽囊結(jié)石形成前期導(dǎo)致NHE3活性增強(qiáng)的分子機(jī)制,我們以鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)和/或forskolin刺激膽管癌細(xì)胞,采用Western blot檢測CDCA和/或forskolin對NHE3、PKCα以及ezrin蛋白的表達(dá)影響;采用免疫共沉淀檢測CDCA對NHE3與ezrin相互作用的影響。結(jié)果:結(jié)果顯示,正常飲食組C57BL/6鼠膽囊膽汁清亮,呈現(xiàn)淡黃色,無結(jié)石形成,成石率為0。致石組所有C57BL/6鼠膽囊膽汁稠厚,可見顆粒狀結(jié)石,呈黃白色,多發(fā),成石率為100%。RT-PCR顯示膽固醇結(jié)石組小鼠膽囊組織中NHE3基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常組(P0.05)。與正常組相比,致石組小鼠的膽囊組織中總NHE3在蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。NHE3在蛋白質(zhì)和基因轉(zhuǎn)錄水平之間的差異可能是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降或NHE3 mRNA翻譯減少的結(jié)果。因為磷酸化可以影響NHE3的轉(zhuǎn)運活性,我們進(jìn)一步檢驗了PS552-NHE3的水平。我們發(fā)現(xiàn)致石組小鼠膽囊組織中NHE3的磷酸化水平顯著高于正常組(P0.05),與膽囊粘膜濃縮功能異常的現(xiàn)象吻合。膽囊粘膜的單層柱狀上皮細(xì)胞表達(dá)NHE3和PS552-NHE3。NHE3蛋白在頂膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),這與NHE3可以在細(xì)胞頂質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)之間轉(zhuǎn)運的報道一致。此外,致石組和正常組之間總NHE3蛋白表達(dá)沒有顯著差異。膽固醇結(jié)石膽囊組織中NHE3的磷酸化水平明顯增高。這些結(jié)果與我們的western blot結(jié)果一致。致石組小鼠的膽囊組織中總ezrin表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異,但是ezrin蛋白的磷酸化水平顯著增高(P0.05)。并且,PKCα以及NHERF1在蛋白表達(dá)水平增高(P0.05)。用NHE3抗體與膽囊粘膜上皮細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,轉(zhuǎn)膜后通過ezrin抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,NHE3免疫沉淀復(fù)合物中含有ezrin蛋白。用ezrin抗體與膽囊粘膜上皮細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,轉(zhuǎn)膜后通過NHE3抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,ezrin免疫沉淀復(fù)合物中含有NHE3蛋白。用NHE3抗體與膽囊粘膜上皮細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,轉(zhuǎn)膜后通過NHERF1抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,NHE3免疫沉淀復(fù)合物中含有NHERF1蛋白。用NHERF1抗體與膽囊粘膜上皮細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,轉(zhuǎn)膜后通過NHE3抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,NHERF1免疫沉淀復(fù)合物中含有NHE3蛋白。上述免疫共沉淀實驗顯示NHE3能夠與NHERF1以及ezrin結(jié)合并形成蛋白復(fù)合體。在PKA激動劑forskolin的協(xié)同作用下,CDCA可以明顯增強(qiáng)NHE3活性抑制因子PKCα的表達(dá)(P0.05),并活化細(xì)胞骨架連接蛋白ezrin(P0.05)。同時,CDCA能夠促進(jìn)ezrin與NHE3形成蛋白復(fù)合體。結(jié)論:高膽固醇飲食誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石這一動物模型成石率高并且經(jīng)濟(jì)可靠,可用于膽石成因的實驗研究。膽囊結(jié)石形成后NHE3的磷酸化水平增高,與膽囊濃縮功能減退的現(xiàn)象相吻合,同時也提示NHE3功能異常與PKA信號通路活性的異常有關(guān)。在膽囊粘膜上皮細(xì)胞,NHE3同時表達(dá)于細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi),這提示NHE3在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運是調(diào)節(jié)其離子交換活性的重要機(jī)制。膽囊結(jié)石形成后粘膜濃縮功能減弱可能與ezrin,PKCα以及NHERF1表達(dá)異常導(dǎo)致的NHE3功能紊亂有關(guān)。膽囊組織中NHE3蛋白復(fù)合物的形成是調(diào)控其離子交換活性的重要機(jī)制之一。膽囊粘膜濃縮功能異常很可能是其暴露于致石膽汁的后果。生理狀態(tài)下,CDCA很可能對膽囊上皮細(xì)胞NHE3的活性具有抑制作用;致石膽汁中CDCA濃度減低可能是結(jié)石形成前期膽囊粘膜濃縮功能增強(qiáng)的重要誘因。通過本項目的系統(tǒng)研究,能夠加深對膽囊結(jié)石發(fā)病機(jī)理的理解,為預(yù)防和治療膽囊膽固醇結(jié)石提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.62
【圖文】：
中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文石率觀察：CON 組 C57BL/6 鼠膽囊膽汁呈現(xiàn)淡黃色，清亮，無石率為 0（0/18）。LITH 組所有 C57BL/6 鼠膽囊內(nèi)可見顆粒 1.3），膽囊膽汁稠厚，成石率為 100%（17/17）。
LITH組膽囊，小鼠膽囊內(nèi)可見顆粒狀黃白色結(jié)石，膽囊膽汁稠厚
.4. RT-PCR 顯示膽固醇結(jié)石組膽囊中 NHE3 mRNA 表達(dá)顯著高于正常醇結(jié)石形成后 NHE3 總蛋白及磷酸化水平的改變。定膽囊吸收功能的降低是否由 NHE3 表達(dá)改變導(dǎo)致，采用 we果顯示，與對照組相比，致石組小鼠的膽囊中總 NHE3 蛋白表異（圖 1.5）。 NHE3 在蛋白質(zhì)和基因水平表達(dá)之間的差異可性下降或 NHE3 mRNA 翻譯減少的結(jié)果。因為磷酸化可以影響換活性，我們進(jìn)一步檢驗了 PS552-NHE3 的水平。我們發(fā)現(xiàn)致中 NHE3 的磷酸化顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0述結(jié)果表明，NHE3 磷酸化水平的改變可能導(dǎo)致其離子交換活 表達(dá)的增加也與膽囊結(jié)石形成后膽囊濃縮功能降低的現(xiàn)象一致
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本文編號：
2760899
