【摘要】：研究背景:炎癥性腸病(IBD)以慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥為主要特征,包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。IBD是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題,在所有人群中的流行率都在急劇上升�；加蠭BD的患者生活質(zhì)量較差,患結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(CAC)的風(fēng)險(xiǎn)高出2到8倍。然而,發(fā)病機(jī)理不清導(dǎo)致相關(guān)藥物及治療手段進(jìn)展緩慢已成為有效治療IBD的最大阻礙。因此,全面闡明IBD發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,為加速有效治療藥物研發(fā)提供理論支持是臨床亟待解決的問(wèn)題。腸黏膜失衡的免疫應(yīng)答是IBD發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。研究證實(shí),在IBD發(fā)病過(guò)程中巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞異常激活,相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-17A等也會(huì)出現(xiàn)異常。而免疫抑制性細(xì)胞,如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)卻存在數(shù)量或功能的缺陷。因此,深入研究腸炎狀態(tài)下免疫細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制,是恢復(fù)腸道免疫穩(wěn)態(tài),防治IBD的關(guān)鍵。另外IBD中存在異常組蛋白修飾,被認(rèn)為是IBD發(fā)病機(jī)制的重要組成部分。組蛋白-賴氨酸N-轉(zhuǎn)甲基酶2(EZH2)是一種重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,其主要功能是通過(guò)催化組蛋白H3第27位的賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生三甲基化(形成H3K27Me3),進(jìn)而沉默下游基因表達(dá)。EZH2能在多方面調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答:促進(jìn)造血干細(xì)胞(HSC)自我更新,維持外周Treg、Th1、Th2、Th17、巨噬細(xì)胞等的數(shù)量及功能。EZH2活性喪失將顯著損害T、B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程,促進(jìn)NK細(xì)胞前體分化發(fā)育,導(dǎo)致骨髓及外周組織中T、B細(xì)胞比例降低,NK細(xì)胞數(shù)量增多。新近報(bào)道顯示,IBD病人結(jié)腸活檢標(biāo)本中EZH2表達(dá)異常。干擾組蛋白調(diào)節(jié)器的功能可能是新治療策略開(kāi)發(fā)的一個(gè)有效途徑。鑒于免疫細(xì)胞在IBD發(fā)病機(jī)制中的已知作用以及EZH2參與免疫細(xì)胞發(fā)育、分化和功能,我們課題著手研究抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性能否通過(guò)改變腸道免疫反應(yīng)影響IBD進(jìn)展。方法:1.研究抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)IBD的作用。采用DSS構(gòu)建C57BL/6小鼠IBD模型,尾靜脈注射EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK343,觀察其對(duì)小鼠病理、腸道、及癥狀改變、并經(jīng)ELISA檢測(cè)相關(guān)炎癥因子變化。2.研究抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)CAC形成的影響。采用AOM聯(lián)合DSS誘導(dǎo)CAC模型,經(jīng)尾靜脈注射GSK343,觀察腫瘤負(fù)荷和患病率等指標(biāo)來(lái)評(píng)估GSK343對(duì)CAC形成的影響。3.探索抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)IBD腸道免疫細(xì)胞的影響。采用DSS構(gòu)建C57BL/6小鼠IBD模型,然后經(jīng)尾靜脈注射GSK343后,使用流式細(xì)胞術(shù)比較GSK343處理組及對(duì)照組小鼠,結(jié)腸固有層(cLP)中Th17、Treg、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和MDSC比例和數(shù)量。結(jié)果:1.抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性能有效緩解炎癥性腸病。GSK343預(yù)防性治療可降低DSS誘導(dǎo)的病理和臨床癥狀,包括體重、DAI、結(jié)腸長(zhǎng)度和組織學(xué)評(píng)分。同時(shí)IL-6和IL-1β水平顯著降低,TNF-α和IL-17a水平未受影響。而當(dāng)IBD形成后再用GSK343治療仍然可以取得顯著的獲益。2.抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性可有效降低CAC的發(fā)病率和腫瘤負(fù)荷。腫瘤模型到第72天,對(duì)照組小鼠100%出現(xiàn)CAC,而GSK343治療組小鼠只有50%出現(xiàn)CAC,并且腫瘤負(fù)荷降低。另一批小鼠觀察到第84天,盡管對(duì)照組和GSK343治療組小鼠的CAC發(fā)生率相似,但GSK343治療組小鼠的腫瘤負(fù)荷顯著降低。3.抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性通過(guò)MDSC富集緩解腸炎。與對(duì)照組相比,GSK343治療組的cLP中,可見(jiàn)Th17、Tregs、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù)在cLP中均無(wú)顯著差異。而MDSC比例增高,腸道原位組織檢測(cè)可見(jiàn)Gr-1陽(yáng)性細(xì)胞增多。使用特異性Gr-1抗體清除MDSCs后,可顯著逆轉(zhuǎn)GSK343對(duì)結(jié)腸炎的保護(hù)作用。結(jié)論:抑制EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性(GSK343)可預(yù)防和治療DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性IBD。同時(shí),由于對(duì)結(jié)腸炎癥的控制,CAC的發(fā)生率和腫瘤負(fù)荷有所降低。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)GSK343所致的MDSC在腸道中富集是其保護(hù)IBD的關(guān)鍵機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R574;R735.3
【圖文】：

圖 1（a）DSS 誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎的方法及 GSK343 給藥。（b）小鼠的體重的變化。（c）疾病活動(dòng)指數(shù)。（d）結(jié)腸長(zhǎng)度的照片和相應(yīng)統(tǒng)計(jì)圖。（e）遠(yuǎn)端結(jié)腸切片的代表性蘇木精和伊紅染色，以及相應(yīng)組織學(xué)評(píng)分。2.3.2 抑制 EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶活性可降低 IBD 腸道組織中細(xì)胞炎癥因子表達(dá)較對(duì)照組，GSK343 處理可導(dǎo)致包括 IL-6 和 IL-1β 在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子水平顯著降低，而 TNF-α 和 IL-17a 的水平未受影響，表明 GSK343 治療降低了 DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎期間的炎癥反應(yīng)。

圖 1（a）DSS 誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎的方法及 GSK343 給藥。（b）小鼠的體重的變化。（活動(dòng)指數(shù)。（d）結(jié)腸長(zhǎng)度的照片和相應(yīng)統(tǒng)計(jì)圖。（e）遠(yuǎn)端結(jié)腸切片的代表性蘇木精和伊紅染色相應(yīng)組織學(xué)評(píng)分。2.3.2 抑制 EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶活性可降低 IBD 腸道組織中細(xì)胞炎癥因子表達(dá)較對(duì)照組，GSK343 處理可導(dǎo)致包括 IL-6 和 IL-1β 在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子水平低，而 TNF-α 和 IL-17a 的水平未受影響，表明 GSK343 治療降低了 DSS 誘導(dǎo)的期間的炎癥反應(yīng)。

但可顯著改善 DAI 評(píng)分（圖 3c）及結(jié)腸炎的其他癥狀，包括結(jié)腸縮短（圖3d）和組織評(píng)分（圖 3e）。以上結(jié)果說(shuō)明抑制 EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì) DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有治療作用。圖 3（a）GSK343 治療 DSS 誘導(dǎo)的 C57BL/6 小鼠急性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（b）小鼠的體重的變化。（c）疾病活動(dòng)指數(shù)。（d）結(jié)腸長(zhǎng)度的照片和相應(yīng)統(tǒng)計(jì)圖。（e）遠(yuǎn)端結(jié)腸切片的代表性蘇木精和伊紅染色，以及相應(yīng)組織學(xué)評(píng)分。2.4 討 論目前，多數(shù)研究者認(rèn)為一般的 IBD 患者不需要太多的藥物預(yù)防干預(yù)，但是大部分IBD 患者在發(fā)作間歇期總是會(huì)有很大的心理焦慮而影響病情。[25]一款安全有效副作用低的預(yù)防藥物在這一領(lǐng)域還是相對(duì)的空白。組蛋白修飾的可逆性使 EZH2 成為治療干預(yù)的合適靶點(diǎn)。雖然 EZH2 似乎是一個(gè)關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子，但其如何影響炎癥和免疫疾病的進(jìn)展仍然不清楚。在這里，我們首次證明，使用低劑量的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（GSK343和 GSK126）干擾 EZH2 活性可改善 DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。具體來(lái)說(shuō)，預(yù)防性使用抑制EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶活性的藥物顯著減少了結(jié)腸炎相關(guān)癥狀，延長(zhǎng)了結(jié)腸炎小鼠的生存期，減少了炎癥因子分泌和促進(jìn)了病理狀態(tài)改善。即使在小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了炎癥性結(jié)腸炎癥狀和體征后，EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的治療依然有良好療效并且明顯改善了預(yù)后。EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑目前正在各種惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究，我們的發(fā)

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本文編號(hào)：2759711