【摘要】： Tim-3對炎性腸病的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究 背景 T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell Immunoglobulin domain and Mucindomain protein-3,Tim-3)是一種最初發(fā)現(xiàn)于活化的Th1細(xì)胞表面的共刺激分子,在結(jié)構(gòu)上屬于T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白(Tim)家族成員。Tim-3分子在維護(hù)體內(nèi)免疫平衡穩(wěn)定中起重要作用。現(xiàn)已知半乳糖結(jié)合蛋白-9(Galectin-9,Gal-9)為Tim-3的天然配體,該分子廣泛表達(dá)于外周免疫系統(tǒng),而其長片斷的Gal-9亞型分子則特異性表達(dá)在腸粘膜及相關(guān)淋巴組織,二者均可與Th1細(xì)胞上的Tim-3分子特異性結(jié)合,引發(fā)Th1細(xì)胞死亡,下調(diào)Th1型免疫反應(yīng),誘導(dǎo)免疫耐受。目前已明確Tim-3分子通過調(diào)節(jié)不同CD~(4+)T效應(yīng)細(xì)胞亞群的功能廣泛參與了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫應(yīng)答過程。而Tim-3是否參與了炎性腸病(InflammatoryBowel Diseases,IBD)的發(fā)生,在炎性腸病中起到什么樣的作用目前還不清楚。 目的 探討Tim-3分子對炎性腸病的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。 方法 利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆Tim-3胞外段基因,構(gòu)建含有小鼠Tim-3胞外段基因的Tim-3_pET32a(+)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,用鎳柱親和純化目的蛋白,通過SDS-PAGE和Western blot方法驗證目的蛋白的純度和特異性。通過直腸灌注三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)的方法建立炎性腸病小鼠模型—TNBS-結(jié)腸炎,從體重、死亡情況,結(jié)腸大體及組織學(xué)改變和細(xì)胞因子變化等方面對模型進(jìn)行評價。在TNBS-結(jié)腸炎小鼠的基礎(chǔ)上腹腔注射Tim-3蛋白,從體重、死亡情況,結(jié)腸大體及組織學(xué)改變等方面觀察Tim-3蛋白對結(jié)腸炎小鼠的影響。通過ELISA檢測IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-23、TGF-β水平的變化,通過FACS檢測小鼠外周血中Tim-3~+細(xì)胞的表達(dá)和小鼠脾細(xì)胞、腸系膜淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的表達(dá)及共刺激分子CD28、CD80、CD86、CTLA-4的表達(dá),通過Real-time PCR法檢測小鼠脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞中Tim-3和Foxp3的表達(dá)。 結(jié)果 成功克隆了小鼠Tim-3基因及其胞外段基因片段;實現(xiàn)了小鼠Tim-3分子的可溶性原核表達(dá)。成功建立了炎性腸病小鼠模型,表現(xiàn)在建模后小鼠出現(xiàn)松毛、精神萎靡、少食、腹瀉、體重下降、死亡等癥狀;結(jié)腸縮短、腸壁增厚,水腫、炎性滲出,呈節(jié)段性炎性改變;結(jié)腸發(fā)生透壁性炎癥,腸壁結(jié)構(gòu)破壞,大量炎性細(xì)胞浸潤;IFN-γ水平升高、IL-4水平降低,IL-17水平升高,小鼠出現(xiàn)Th1、Th17細(xì)胞偏移;前炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯升高。在TNBS-結(jié)腸炎建模前12hr腹腔注射Tim-3蛋白能夠明顯加重小鼠結(jié)腸炎癥狀,表現(xiàn)在小鼠體重明顯下降和死亡率明顯增加,結(jié)腸大體標(biāo)本和組織切片結(jié)果均提示結(jié)腸炎小鼠病理損傷進(jìn)一步加重,并且結(jié)腸炎癥狀與小鼠體內(nèi)Tim-3~+細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān);前炎性因子IFN-γ、IL-17、IL-23水平明顯升高,而抗炎性因子IL-4、TGF-β水平明顯下降;經(jīng)典的Treg細(xì)胞群即表達(dá)CD25、Foxp3的CD4~+T細(xì)胞數(shù)目減少;腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞CD80的表達(dá)水平下降,同時CD4~+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)降低而CD28的表達(dá)升高。 結(jié)論 Tim-3分子可能通過對共刺激分子CD28、CD80、CTLA-4的調(diào)節(jié),影響CD4~+T效應(yīng)細(xì)胞不同亞群的極化,發(fā)揮對炎性腸病的負(fù)調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R574
【圖文】：

由于N端融合了Trx蛋白和(His)6標(biāo)簽，所以Tim一3蛋白產(chǎn)物的分子量約為37KDa。用構(gòu)建正確的Tim一3一ET犯a(+)載體轉(zhuǎn)化 E.cohBL一21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，圖1一4顯示了誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)菌上清和沉淀SDS一PAGE分析圖譜，可見在37KDa處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)測的分子量大小一致，并且初步提示Tim一3蛋白在上清中大量表達(dá)。圖1一5顯示了誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)菌上清和沉淀 WestemBlot鑒定分析圖譜，可見在37KDa處有明顯的特異性蛋白條帶，并且確定了Tim一3蛋白主要在上清中表達(dá)。9466，24535262014_4圖1一 4SDS一隊GE分析Ti二3蛋白的表達(dá):14.4KDa-94KDa蛋白Marker;2:.pet32a空載體誘導(dǎo)全菌;3:pet32a一Tim一3未誘導(dǎo)對照;4一6:pet32a-Tim一3誘導(dǎo)上清;7一9:pet32a一Tim一3誘導(dǎo)沉淀。 23456了89一…嘴鞘彝麟睽臀一3”確帶一一一圖1一 5westernBlot鑒定Ti二3蛋白的表達(dá):14.4KDa一94KDa蛋白Marker;2:pet32a空載體誘導(dǎo)全菌;3:pet32a一Tim一3未誘導(dǎo)對照:4一6:pet32a-Tim一3誘導(dǎo)上清;7一9:pet32，Tim一3誘導(dǎo)沉淀。

37KDa處有明顯的特異性蛋白條帶，并且確定了Tim一39466，24535262014_4圖1一4SDS一隊GE分析Ti二3蛋白的表達(dá)KDa蛋白Marker;2:.pet32a空載體誘導(dǎo)全菌;3:pet32a一Tim一3未4一6:pet32a-Tim一3誘導(dǎo)上清;7一9:pet32a一Tim一3誘導(dǎo)沉淀。

由于N端融合了(His)6標(biāo)簽，所以采用鎳柱純化目的蛋白。在實驗中分別用10mM、 50mM、 100mM、 200mM、 500mM咪哇進(jìn)行梯度洗脫，收集各階段洗脫峰進(jìn)行SDS一隊GE檢測，圖1一6顯示了鎳柱純化后各階段洗脫峰分析圖譜，在 100n1M咪啤后半部分洗脫液、 200mM咪哇洗脫液、 500mM咪吟洗脫液中含有純度較高的目的蛋白。用抗小鼠的Tim一3特異性抗體對純化后獲得的Tim一3蛋白進(jìn)行 WesternBlot鑒定，圖1一7顯示了Tim一3蛋白特異性檢測的 WesternBlot圖譜，第1、2泳道可見在37KDa處有特異性的目的條帶。 234567891094662舀)交父歲仁笆鉀毅欲扮石鉆派扁二節(jié)爵瀚繁臀~“’ 556 432烹黔嘿黔嘿黔一..腳..，......祠.自目幼....曰，加一圖1一6鎳柱純化后各階段洗脫峰分析圖譜:14.4KDa一94KDa蛋白Marker;2:上樣前;3:上樣后;4:10mM咪哇洗脫; 5:50mM咪哇洗脫;6一 8:100mM咪哇洗脫 :9:200mM咪哇洗脫 ;10:500mM咪l些洗脫。 234537K0...曲戶赫愧曝月口.門協(xié)34KD25KD書gKD圖1一 7Tinr--3蛋白特異性檢測的WesternBlot圖譜一2:Tim一3蛋白;3:陰性對照;4:空白對照 ;5:14.4KDa一94KDa蛋白Markero

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本文編號：2757637