【摘要】： 肝功能衰竭是各種嚴(yán)重肝病的終末期表現(xiàn),是威脅人類健康的重要原因之一,雖然原位肝移植是目前治療肝細(xì)胞衰竭的最有效手段,但卻受到捐獻(xiàn)器官短缺和手術(shù)費(fèi)用較高的限制,而建立有效的人工肝治療,一方面可以為尋求合適的肝移植供體提供時(shí)間,另一方面可以為肝細(xì)胞再生爭(zhēng)取時(shí)間。目前各種物理型人工肝輔助治療系統(tǒng)雖然有不錯(cuò)的療效,但仍無(wú)法替代肝臟的各種復(fù)雜生物學(xué)功能。隨著細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展,體外生物人工肝支持系統(tǒng)(extracorporeal bioartificial liver support system,EBLSS)在肝功能衰竭治療方面的應(yīng)用,正日益受到人們的關(guān)注。原代人肝細(xì)胞無(wú)疑是體外生物人工肝支持系統(tǒng)的治療最為理想的肝細(xì)胞來(lái)源,但原代人肝細(xì)胞,增殖傳代極為困難;動(dòng)物源性肝細(xì)胞雖可大量獲得,卻有著極大的風(fēng)險(xiǎn),包括使病人出現(xiàn)人畜共患疾病(如使用豬肝細(xì)胞治療有潛在的感染豬內(nèi)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能)以及異種蛋白進(jìn)入病人體內(nèi)導(dǎo)致免疫反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn),因此合適的肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題仍是制約生物人工肝發(fā)展的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。目前,通過(guò)永生化的方法設(shè)計(jì)建立能無(wú)限增殖并具有良好生物代謝功能的人源性肝細(xì)胞系是解決肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的主要研究方向之一。 本課題通過(guò)將hTERT基因?qū)氤扇烁渭?xì)胞HL-7702,構(gòu)建了永生化成人肝細(xì)胞系(pLN/HL-7702),并且對(duì)導(dǎo)入hTERT基因前后兩種細(xì)胞的形態(tài)、增殖狀況、生物學(xué)功能進(jìn)行了比較和研究,對(duì)新建永生化成人肝細(xì)胞系(pLN/HL-7702)致瘤性問(wèn)題進(jìn)行了初步研究,以期為進(jìn)一步研究解決生物人工肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究將攜帶有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入成人肝細(xì)胞HL-7702,通過(guò)RT-PCR,western-blot,和IEA(間接免疫熒光法)在基因和蛋白水平對(duì)所建細(xì)胞系(pLN/HL-7702)進(jìn)行了鑒定;在倒置相差顯微鏡和透射電鏡下觀察并比較了基因?qū)肭昂蠹?xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu);采用MTT染色法檢測(cè)在基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞的增殖能力變化,連續(xù)觀察并描繪生長(zhǎng)曲線;采用RT-PCR法檢測(cè)基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞功能基因表達(dá)情況;采用western-blot檢測(cè)基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞細(xì)胞色素P450的表達(dá);并通過(guò)軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)對(duì)所建細(xì)胞系pLN/HL-7702的致瘤性進(jìn)行了初步分析。 結(jié)果:1.RT-PCR、western-bolt和IEA可檢測(cè)到hTERT基因在肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá),可檢測(cè)到相關(guān)蛋白;2.光鏡和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞的差異;3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞在導(dǎo)入基因后增殖能力有了明顯的提高;4.肝細(xì)胞功能基因的轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)染前后均可檢測(cè)到;5.基因?qū)肭昂蠹?xì)胞上清的檢測(cè)表明肝細(xì)胞的一般生化功能未受影響;6.基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞通過(guò)western-bolt均可檢測(cè)到細(xì)胞色素P450的表達(dá);7.軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)未提示pLN/HL-7702有致瘤性表現(xiàn)。 討論:本研究成功建立永生化成人肝細(xì)胞系pLN/HL-7702,其體外增殖能力較原細(xì)胞系HL-7702明顯提高,在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能方面與基因?qū)肭盁o(wú)明顯差異,并可檢測(cè)到細(xì)胞色素P450的表達(dá),初步致瘤性分析未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有致瘤性,提示該細(xì)胞系進(jìn)一步研究后有可能為生物人工肝的治療提供一種安全有效的肝細(xì)胞來(lái)源。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575.3;R318
【圖文】：

1.質(zhì)粒pLNCXZ一hTERT經(jīng)核酸內(nèi)切酶HindHI和NOtl雙酶切后，形成兩個(gè)大小為6.Ikb與4kb左右的片段，結(jié)果符合預(yù)期。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后顯示如圖1:圖1質(zhì)粒pLNCxZ一hTERT酶切瓊脂糖凝膠電泳圖 :DNAmarkerD[J1500O2:pLNCXZ一h‘fE尺 rfd1gestedwithHindlll/Notl

軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩十學(xué)位淪文篩選出的肝細(xì)胞克隆群落(倒置相斧顯微鏡，X100PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后兩組肝細(xì)胞均‘lJ一在51Zbp左右檢測(cè)到11預(yù)期，目轉(zhuǎn)染后hTERT基因mRNA水平較轉(zhuǎn)染前有uanti嘆One一462_pC灰度掃描后的峰值比較，，，J‘見(jiàn)轉(zhuǎn)前。如圖3所示:

軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩十學(xué)位淪文濃度(x)。蛋自定量圖4所示:S二6328734748r二0.的794189戶戶戶夕夕娜戶砂砂護(hù)滬砂沙.

本文編號(hào)：2756836