【摘要】：【研究背景及目的】 肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟在持續(xù)的肝實質(zhì)細(xì)胞破壞或慢性炎癥等慢性損傷條件下發(fā)生的一種常見的修復(fù)過程，表現(xiàn)為富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）沉積過多而降解減少，最終導(dǎo)致肝組織疤痕形成及正常結(jié)構(gòu)破壞。這一過程主要由肝臟內(nèi)來源各異的肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFs）驅(qū)動，而肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）是肌成纖維細(xì)胞最主要的來源之一。作為肝臟中最重要的間質(zhì)細(xì)胞類型，靜息的HSC（differentiated HSC）主要司職脂溶性維生素A的貯存。肝臟發(fā)生慢性損傷后，調(diào)控諸多激活因子如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）、血小板衍生生長因子（PDGF）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，氧化應(yīng)激增多，促進(jìn)靜息的HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（myofibroblastictrans-differentiation），即發(fā)生活化，表現(xiàn)為儲脂功能下降，獲得增殖能力并產(chǎn)生大量膠原。鑒于HSC在肝纖維化發(fā)生中的重要地位，既往已利用抑制HSC活化或誘導(dǎo)其凋亡來治療肝纖維化，但尚未取得令人滿意的臨床療效。 近年來關(guān)于肝纖維化的治療出現(xiàn)了一些新的分子靶點，微小RNA（microRNA，miRNA）是其中的研究熱點之一。miRNA是內(nèi)源性非編碼雙鏈RNA，對基因表達(dá)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。新近有諸多研究表明miRNA在病毒性肝炎、酒精性或非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的病理過程中發(fā)揮重要作用。其中有研究表明miRNA在肝纖維化發(fā)生過程中存在異常表達(dá)，并可通過調(diào)控HSC的增殖和凋亡發(fā)揮促進(jìn)或抑制肝纖維化的作用，提示通過外源性調(diào)控相關(guān)miRNA表達(dá)可能成為治療肝纖維化的新手段。 miR-134位于Dlk1/Dio3印記基因區(qū)域內(nèi)的miRNA簇中，該區(qū)域位于人14號染色體和小鼠12號染色體。既往研究表明miR-134主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。它可促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、樹突脊形成并調(diào)控突觸可塑性，其表達(dá)異常與少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。新近有研究表明miR-134與同簇的一些miRNA在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在肝纖維化和肝癌發(fā)生發(fā)展過程中失調(diào)的重要轉(zhuǎn)錄因子肝細(xì)胞核因子4α可通過調(diào)控miR-134抑制肝癌的惡性表型，提示miR-134在肝臟的病理生理過程中也可能扮演重要角色。但目前為止，關(guān)于miR-134在肝纖維化中的作用尚未見報道。因此，本課題旨在明確miR-134在肝纖維化發(fā)生中的作用，并初步探討其作用機制。 【實驗方法】 一、miR-134在大鼠肝纖維化模型組織和大鼠肝星狀細(xì)胞中的表達(dá) 1、檢測正常大鼠肝組織及大鼠肝纖維化模型肝組織中miR-134表達(dá)將18只雄性SD大鼠（180g-200g）隨機分為3組，每組6只。第1組為正常對照組，第2組和第3組給予1%二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine, DMN）100μl/100g體重腹腔注射，每周連續(xù)注射3天。第2周處死第2組，第4周處死第3組，留取肝組織，real time RT-PCR分別檢測miR-134表達(dá)，比較模型組肝組織與正常組肝組織表達(dá)差異。參照本實驗室以往方法制備膽總管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）大鼠肝纖維化模型（n=24），其中6只僅開腹未予未予膽管結(jié)扎，即為假手術(shù)組，并在造模1周、2周以及3周后各處死6只大鼠。取相同部位肝組織，real time RT-PCR檢測miR-134表達(dá)，比較各組表達(dá)差異。 2、比較大鼠原代肝星狀細(xì)胞靜息狀態(tài)和活化后miR-134的差異表達(dá) 分離正常大鼠原代肝星狀細(xì)胞，在體外予DMEM培液培養(yǎng)。收取體外培養(yǎng)后第3天（靜息）、第6天、第9天和第12天細(xì)胞的RNA，realtime RT-PCR法檢測各組細(xì)胞miR-134以及HSC活化標(biāo)志物α平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和I型膠原（collagen I）mRNA表達(dá)。 3、檢測并比較TGFβ1刺激前后miR-134的差異表達(dá)用不同濃度的TGFβ1（0ng/ml、2ng/ml和4ng/ml）處理大鼠肝星狀細(xì)胞株T6細(xì)胞，抽取處理48小時后的細(xì)胞RNA，real time RT-PCR法檢測各組細(xì)胞miR-134以及HSC活化標(biāo)志物α-SMA和collagen I mRNA表達(dá)。 二、體外調(diào)控miR-134表達(dá)對T6細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 1、上調(diào)miR-134表達(dá)對T6細(xì)胞生物學(xué)特性的影響用lipofectamine2000將大鼠miR-134擬似物（miR-134mimic）轉(zhuǎn)染至T6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后抽取細(xì)胞RNA和蛋白，real time RT-PCR檢測miR-134及HSC活化標(biāo)志物α-SMA和Collagen I mRNA的表達(dá)；western blot法檢測α-SMA和Collagen I蛋白表達(dá)。利用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit8，CCK8）檢測細(xì)胞數(shù)量，繪制生長曲線，觀察上調(diào)miR-134對HSC增殖能力的影響。 2、抑制miR-134作用對T6細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 用lipofectamine2000將2′-甲氧修飾的大鼠miR-134互補鏈（miR-134inhibitor）轉(zhuǎn)染至T6細(xì)胞中，real time RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染48小時后HSC活化標(biāo)志物α-SMA和Collagen I mRNA表達(dá)，western blot法檢測其蛋白表達(dá)。同時利用CCK8法檢測定轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor對HSC增殖能力的影響。 三、初步探討miR-134在肝纖維化中的作用機制 1、通過軟件預(yù)測miR-134潛在靶基因利用TargetScan（www.targetscan.org）軟件預(yù)測miR-134靶基因，發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5b（Signal transducers and activators of transcription5B，STAT5B）為其潛在靶基因。檢測T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134mimic或inhibitor后STAT5B的mRNA和蛋白表達(dá)。 2、驗證miR-134對STAT5B的靶向調(diào)控作用 構(gòu)建含有miR-134在STAT5B3′-UTR結(jié)合位點的熒光素酶報告基因載體以及該位點突變的報告基因，與miR-134mimic或陰性對照NC共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，檢測報告基因質(zhì)粒熒光素酶活性，驗證STAT5B是否為miR-134的靶基因。利用realtime RT-PCR法檢測TGFβ1刺激T6細(xì)胞后STAT5B mRNA的表達(dá)，并分析其與miR-134表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步明確miR-134與STAT5B的關(guān)系。 四、統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以X±SD表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。多組間采用One-WayANOVA分析，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗。分別計算P值，P 0.05為具有顯著性差異，P 0.01為具有非常顯著性差異。 【實驗結(jié)果】 一、miR-134在大鼠肝纖維化模型肝組織和活化的大鼠肝星狀細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) 1、與正常大鼠肝組織相比，大鼠DMN及BDL肝纖維化模型肝組織中miR-134表達(dá)下調(diào) real time RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常大鼠肝組織相比，DMN肝纖維化模型組大鼠肝組織中miR-134表達(dá)逐漸下調(diào)（P 0.05）。與假手術(shù)組大鼠肝組織相比，BDL模型組肝組織隨時間延長miR-134的表達(dá)逐漸下降（P 0.05）。 2、大鼠原代肝星狀細(xì)胞在體外培養(yǎng)后活化且miR-134表達(dá)下調(diào) real time RT-PCR結(jié)果顯示，大鼠原代肝星狀細(xì)胞在體外培養(yǎng)6天后α-SMA和Collagen I表達(dá)開始上調(diào)，miR-134表達(dá)開始下降，此后隨時間延長，α-SMA和CollagenI表達(dá)逐漸上調(diào)，miR-134表達(dá)逐漸下降。 3、TGFβ1刺激T6細(xì)胞后miR-134表達(dá)下調(diào)用不同濃度的TGFβ1刺激大鼠T6細(xì)胞48小時，real time RT-PCR結(jié)果顯示，TGFβ1處理后α-SMA和Collagen I表達(dá)顯著上調(diào)，提示T6細(xì)胞進(jìn)一步活化，而miR-134表達(dá)顯著下調(diào)，且呈濃度依賴性。 二、miR-134可抑制T6細(xì)胞增殖及膠原等指標(biāo)表達(dá) 1、上調(diào)miR-134表達(dá)可抑制T6細(xì)胞生物學(xué)特性T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134mimic及對照NC48小時后，real time RT-PCR結(jié)果顯示與NC相比，miR-134mimic組α-SMA以及Collagen I的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)；westernblot結(jié)果顯示二者的蛋白表達(dá)亦顯著減少。生長曲線結(jié)果顯示miR-134mimic可顯著抑制T6細(xì)胞的增殖能力。 2、抑制miR-134活性后T6細(xì)胞膠原表達(dá)增加，增殖加快 T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor及對照inhibitor NC48小時后，real time RT-PCR結(jié)果顯示與inhibitor NC相比，miR-134inhibitor組α-SMA以及Collagen I的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)；western blot結(jié)果顯示二者的蛋白表達(dá)亦顯著增加。生長曲線結(jié)果顯示miR-134inhibitor可顯著提高T6細(xì)胞的增殖能力。 三、miR-134在星狀細(xì)胞中靶向調(diào)控STAT5B 1、miR-134調(diào)控STAT5B的表達(dá)real time RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-134mimic后STAT5B mRNA表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor后， mRNA表達(dá)上調(diào)；western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-134mimic后STAT5B蛋白表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor后，STAT5B蛋白表達(dá)上調(diào)。 2、STAT5B是miR-134的直接靶基因 含有miR-134在STAT5B3′-UTR結(jié)合位點的熒光素酶報告基因載體（野生型）以及該位點突變的報告基因（突變型）與miR-134mimic或陰性對照NC共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，雙報告基因試劑盒檢測結(jié)果顯示miR-134mimic可降低野生型報告基因的熒光活性，而對突變型報告基因的活性無影響。TGFβ1刺激T6細(xì)胞后STAT5BmRNA的表達(dá)上調(diào)，與miR-134表達(dá)呈相反趨勢，進(jìn)一步說明miR-134調(diào)控STAT5B。 【結(jié)論】 一、miR-134隨肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化模型進(jìn)展表達(dá)逐漸減少，提示其與肝纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 二、miR-134可抑制肝星狀細(xì)胞株膠原表達(dá)和增殖能力。 三、miR-134在星狀細(xì)胞中靶向調(diào)控STAT5B表達(dá)，可能為其作用的分子機制。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2
【圖文】：

型組大鼠逐漸出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，毛發(fā)凌亂無光澤，食欲差，活動量少，精神萎靡，界刺激反應(yīng)慢。（二）BDL 誘導(dǎo)肝纖維化動物模型的建立6 只假手術(shù)對照組大鼠精神飽滿，毛發(fā)亮澤，食欲佳，活動靈敏。18 只 BDL組大鼠毛發(fā)發(fā)黃，精神萎靡，食欲差，活動少。（三）miR-134 在肝纖維化的大鼠肝組織中表達(dá)下調(diào)取肝纖維化模型組大鼠和對照大鼠肝組織，抽提 RNA，real time RT-PCR 結(jié)果在 BDL 模型中，隨著肝纖維化的發(fā)展，miR-134 的表達(dá)明顯下降，BDL 模型 we較假手術(shù)對照組下調(diào) 76%；DMN 模型組中 miR-134 的表達(dá)也隨肝纖維化的發(fā)展步下降，DMN 模型 week4 組較對照組下調(diào) 71%（圖 1-1），提示 miR-134 與肝纖發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

miR-134 在肝纖維化中的作用及其機制二、大鼠原代肝星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)后 miR-134 表達(dá)的變化（一）大鼠原代 HSC 體外培養(yǎng)后 HSC 活化標(biāo)志物的表達(dá)原代大鼠 HSC 分離后于體外培養(yǎng)，鏡下觀察 HSC 由多角形逐漸向肌成纖維胞方向發(fā)展，real time RT-PCR 結(jié)果顯示活化標(biāo)志物 α-SMA 和 collagen I 的表間延長逐漸上調(diào)，提示原代 HSC 體外培養(yǎng)過程中逐漸自發(fā)活化（圖 1-2）。

胞活化后 α-SMA（A）和 Collagen I（B）的表代 HSC 體外培養(yǎng)過程中 miR-134 表達(dá)逐養(yǎng)后第3天，第6天、第9以及第12天抽提RNA后第 6 天，miR-134 表達(dá)開始明顯下降，此后相比 miR-134 表達(dá)下降 65%（p < 0.01）（圖 1程密切相關(guān)。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2751566