【摘要】： 盡管有高效的疫苗進(jìn)行預(yù)防,臨床上也開始使用多種抗病毒藥物如干擾素-α(IFN-α)及核苷類似物等進(jìn)行治療,但慢性乙型肝炎仍嚴(yán)重威脅著人們的健康。近年來基因治療在抗HBV治療方面取得了較大進(jìn)展,如核酶、Dominantnegative突變體(DN突變體)和小干擾RNA(siRNA)等。本課題用腺病毒載體基因改造的類似方法重組HBV基因組,保留HBV的包裝信號(hào),在X基因翻譯起始部位引入終止子以終止X蛋白的表達(dá),全長(zhǎng)的C基因與S基因融合使C-S融合蛋白取代包裝所需的核衣殼蛋白和表面蛋白,在重組HBV基因組后通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site,IRES)連接了IL-2基因,構(gòu)建了雙表達(dá)載體。該重組HBV基因組利用HBV的天然嗜肝特性,在患者肝細(xì)胞內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性利用HBV野毒株的C蛋白和S蛋白包裝病毒,將C、S蛋白融合產(chǎn)生的DN突變體的抗HBV作用在有野毒株存在的肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)、放大作用;不表達(dá)X蛋白,消除了X蛋白的反式激活、損害宿主細(xì)胞的不利影響;并利用IRES同時(shí)表達(dá)IL-2以增強(qiáng)抗HBV的作用。 一、基于腺病毒載體HBV復(fù)制缺陷重組體的構(gòu)建 以含1.3拷貝HBV野毒株基因組的質(zhì)粒1.3 x wt HBV in pGEM3Z(p1.3HBV)為模板,分別以KpnⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/HindⅢ酶切并將酶切得到的2.4Kb、1.8Kb的HBV基因片斷克隆至pUC19載體,使p1.3HBV含有的兩個(gè)X基因克隆至pUC19載體,命名為2.4Kb/pUC19(還包含C基因和S基因的起始部分)和1.8Kb/pUC19。用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?設(shè)計(jì)引物使X基因的第8位氨基酸的密碼子從CAA突變成終止密碼子TAA。同樣的方法,以2.4Kb/pUC19質(zhì)粒為模板,以限制性內(nèi)切酶MluⅠ位點(diǎn)(-ACGCGT-)取代C基因終止子密碼子,且在S基因起始密碼子前插入MluⅠ酶切位點(diǎn)。用MluⅠ單酶切該突變質(zhì)粒以切除C基因末端與S基因起始密碼子之間的序列,回收的大片斷以T4連接酶連接產(chǎn)生CS融合基因。再次設(shè)計(jì)引物,刪除C、S基因之間的MluⅠ酶切位點(diǎn)(-ACGCGT-),并將CS+X~-克隆到腺病毒載體PDC316上構(gòu)建成CS+X~-/PDC316。 二、CS+X~--IRES-IL-2/PDC316雙表達(dá)重組體的構(gòu)建 以質(zhì)粒IRES/pMD18-T為模板,設(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR反應(yīng)在IRES基因片斷兩端引入SalⅠ酶切位點(diǎn),克隆到載體pMD18-T。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后以SalⅠ單酶切質(zhì)粒,將IRES克隆至PDC316質(zhì)粒載體。以BamHI酶切IL-2/MNSM,將切下的IL-2基因定向克隆到IRES/PDC316質(zhì)粒,構(gòu)建了IRES-IL-2/PDC316質(zhì)粒。以SalⅠ酶切IRES-IL-2/PDC316質(zhì)粒,將IRES-IL-2基因片斷定向克隆到CS+X~-/PDC316,構(gòu)建了的CS+X~--IRES-IL-2/PDC316雙表達(dá)質(zhì)粒。 三、復(fù)制缺陷的乙型肝炎病毒重組體抑制野毒株作用的體外研究 將PCH3143質(zhì)粒上的缺失包裝信號(hào)的HBV基因組克隆至PDC316載體構(gòu)建成輔助質(zhì)粒3143/PDC16。應(yīng)用脂質(zhì)體將構(gòu)建的CS+X~--IRES-IL-2/PDC316、CS+X~-/PDC316與輔助質(zhì)粒3143/PDC16共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,并分別以質(zhì)粒CS+X~--IRES-IL-2/PDC316、1.3HBV/PDC316、3143/PDC316單獨(dú)轉(zhuǎn)染為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),1)以MTT比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的毒性;2)以RT-PCR檢測(cè)CS+X~--IRES-IL-2/PDC316轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的表達(dá),以雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-2;3)提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒,以過量的DNaseⅠ消化過剩的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后進(jìn)行PCR以檢測(cè)上清中的HBV顆粒。結(jié)果證實(shí):1)轉(zhuǎn)染復(fù)制缺陷的HBV重組體對(duì)細(xì)胞無毒性作用;2)單獨(dú)轉(zhuǎn)染復(fù)制缺陷的HBV重組體可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生C-S融合蛋白,上清中的IL-2的表達(dá)量為(7.89±0.21ng/ml),但該重組體不能包裝成病毒顆粒分泌至細(xì)胞上清中;3)復(fù)制缺陷的HBV基因組在HBV輔助質(zhì)粒3143/PDC316的幫助下能有效復(fù)制并包裝成子代病毒顆粒分泌到胞外。 為觀察復(fù)制缺陷的HBV重組體對(duì)野毒株的作用,將HepG2細(xì)胞分別用以下質(zhì)�；蛑亟M體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染:1)CS+X~-/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316質(zhì)粒,2)CS+X~--IRES-IL-2/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316,3)PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)的細(xì)胞和上清進(jìn)行用定量PCR進(jìn)行HBV的定量檢測(cè)檢測(cè)。結(jié)果顯示,三組細(xì)胞中的HBV定量分別為6.45×10~6copies/ml、5.75×10~6copies/ml和2.23×10~7copies/m,CS+X~-/PDC316、CS+X~--IRES-IL-2/PDC316對(duì)野毒株的抑制率分別為71.08%、75.29%,上清中的病毒定量分別為4.06×10~6copies/ml,5.06×10~6copies/ml和1.87×10~7copies/ml,CS+X~-/PDC316、CS+X~--IRES-IL-2/PDC316對(duì)野毒株的抑制率分別為74.20%、72.94%。這些結(jié)果表明,復(fù)制缺陷的HBV重組體在體外能有效抑制HBV野毒株的復(fù)制。 結(jié)論: 本課題成功構(gòu)建了一種全新的、基于腺病毒載體、能表達(dá)IL-2的復(fù)制缺陷HBV重組體。該重組體與包裝信號(hào)序列缺失的輔助質(zhì)粒PCH3143共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后可進(jìn)行包裝、復(fù)制,與HBV野毒株共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞則可顯著抑制HBV野毒株的復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

組的基因長(zhǎng)度與1.1拷貝和1.2拷貝類似，但復(fù)制效率高，是兼顧復(fù)制效率和克隆基因組大小的較為理想的克隆模板[43]。因此，本課題采用 PI.3HBv為模板。Fig.18為 PI.3HBv的結(jié)構(gòu)示意圖，F(xiàn)ig.19為其酶切示意圖。R.3之2111 1.J、 111弓、4，奮sbp Fig.18pl.3HBV的結(jié)構(gòu)示意圖

各組HePGZ細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性從表1和圖1可以看到，上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)HePGZ的生長(zhǎng)沒有明顯影響

突變株完全互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物大小一致，即兩者的PCR模板是一致的，PCR反應(yīng)的條件、檢測(cè)的靈敏度應(yīng)該是一致的，可以互為對(duì)照，因此選用該引物作為擴(kuò)增引物。常規(guī)PCR電泳結(jié)果見圖6。 123452000bP 1000bP;}};l圖6常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳

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本文編號(hào)：2749830