發(fā)布時間：2020-07-11 01:21

【摘要】： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白需肌醇酶1(IRE1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)的核心感受器,可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)未折疊蛋白的聚集并將這種刺激傳遞至細胞其他區(qū)域。近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與多種肝臟疾病有關(guān),如病毒感染(乙肝、丙肝),糖尿病-肥胖癥相關(guān)的肝臟疾病,酒精性肝病,α1-抗胰蛋白酶缺乏癥及缺血再灌注損傷等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的未折疊蛋白反應(Unfolded Protein Response,UPR)可通過誘導分子伴侶表達上調(diào),關(guān)閉蛋白翻譯等降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白負荷,但持續(xù)過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應則導致細胞凋亡。為闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與肝細胞凋亡的關(guān)系,本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與IRE1相互作用的蛋白質(zhì),為進一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在肝臟疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。 1.酵母雙雜交系統(tǒng)篩選IRE1相互作用蛋白質(zhì):采用酵母雙雜交的方法,分別以hIRE1α(人IRE1α)N端段1～465位氨基酸及C端段468～977位氨基酸為誘餌,與人睪丸cDNA文庫質(zhì)粒順序轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株,經(jīng)三重/四重營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基及X-α-GAL半乳糖苷酶試驗篩選,將PCR鑒定為陽性的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,提取質(zhì)粒并測序,進行生物信息學分析。最后通過酵母回轉(zhuǎn)雜交實驗對獲得的相互作用加以驗證。結(jié)果:成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-IRE1N及pGBKT7-IRE1C,并在酵母中正確表達融合蛋白,自激活檢測及毒性檢測均為陰性。分別篩選出8個及15個與IRE1相互作用的蛋白質(zhì);通過回轉(zhuǎn)實驗驗證,確定了能與IRE1 C端段相互作用的蛋白質(zhì)RACK1。RACK1是由SCOTIN基因編碼的支架蛋白,可細胞內(nèi)多種激酶相互作用,介導激酶與底物的結(jié)合。 2.驗證IRE1與RACK1在哺乳動物細胞及體外的相互作用:(1)構(gòu)建真核表達載體3XFLAG-IRE1C, GFPC3-RACK1,雙酶切及測序鑒定正確,以GFPC3空載體作為對照,共同轉(zhuǎn)染293T細胞,利用免疫共沉淀技術(shù)驗證IRE1與RACK1在哺乳動物細胞中的相互作用。( 2 )構(gòu)建原核表達載體pGEX-6p2-RACK1,pGEX-6p1-IRE1C,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導融合蛋白表達并純化,其中以precision酶切GST-RACK1融合蛋白,獲得不帶GST TAG的RACK1蛋白,與空GST蛋白為對照,分別與GST-IRE1C孵育,體外Pull-down實驗驗證IRE1與RACK1的相互作用。(3)構(gòu)建真核表達質(zhì)粒GFPC3-IRE1WT,轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2,同時以RACK1單抗及抗鼠-Rodamine為二抗進行免疫熒光實驗,檢測IRE1及RACK1在肝細胞中的定位。結(jié)果:通過體內(nèi)及體外實驗分別驗證IRE1與RACK1相互作用的存在,且證明IRE1 C端為RACK1結(jié)合部位,免疫熒光證實IRE1與RACK1在肝細胞內(nèi)有共定位,為其相互作用提供可靠依據(jù)。 3.RNA干擾實驗探討RACK1對IRE1功能的影響:(1)轉(zhuǎn)染RACK1 SiRNA入HepG2細胞,48小時后收取細胞裂解液,進行Western blot驗證基因敲除效果。給予敲除RACK1的細胞以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導藥物衣霉素(Thapsigargin,TG)處理,通過western blot檢測IRE1的磷酸化及其下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的表達,同時應用RT-PCR檢測XBP-1 mRNA的表達及其剪切,確定RACK1敲除對IRE1功能的影響。(2)相同方法敲除HepG2細胞中RACK1的表達,給予不同劑量的TG處理,TUNEL法檢測RACK1敲除對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時肝細胞凋亡的影響。結(jié)果:成功敲除HepG2細胞中RACK1的表達,Western blot及RT-PCR證實RACK1敲除可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時IRE1的功能活化,同時抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝細胞凋亡的誘導。 結(jié)論:本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)IRE1與RACK1的相互作用,并通過體內(nèi)、體外多種方法證實其相互作用的存在,最后通過RNA干擾及功能試驗證實IRE1對ER stress的感受及活化,對分子伴侶的誘導及XBP-1的剪切,以及細胞凋亡的誘導,均依賴于RACK1的存在,提示RACK1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應信號通路中不可或缺的一個環(huán)節(jié),與ER stress下肝細胞的凋亡密切相關(guān),進一步的研究對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的肝臟疾病有重要意義。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575
【圖文】：

圖 1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜信號蛋白及主要通路4. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應與細胞凋亡ESR 對 ER 穩(wěn)態(tài)的重建體現(xiàn)了它的細胞保護作用，然而持續(xù)、過強的應激導致 ER 功能紊亂無法被糾正時，多細胞真核生物則啟動凋亡信號，清除受損的細胞，防止應激損傷進一步擴大。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡與傳統(tǒng)的外源性/內(nèi)源性凋亡通路均有交叉，且存在其特異性的凋亡信號傳導途徑，如 caspase-12，以下詳述。4.1 內(nèi)源性凋亡途徑ER stress時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Bak及Bax構(gòu)象發(fā)生改變并且/或二聚化導致ER 鈣離子釋放[85]。ER 鈣庫的波動導致胞漿內(nèi)calpain的活化，進而切割pro-caspase-12 生成caspase-12。活化的caspase-12 通過caspase-9 及caspase-3[86-87]激活caspase cascade。這一通路與傳統(tǒng)內(nèi)源性凋亡途徑的Apaf-1 及線粒體細胞色素c的釋放無關(guān)，為ER stress特異的獨立凋亡通

stress誘導凋亡有部分抵抗作用[90-91]，提示caspase-12 與chop介導ERstress特異性的細胞凋亡。ER stress時IRE1 的活化可募集TRAF2，而TRAF2 促進procasp se-12聚集a[92]，這是procaspase-12 活化必不可少的條件。ER stress上調(diào)procaspase-12 的 表 達 ， 實 驗 證 實 ， caspase-12 過 表 達 可 活 化procaspase-12[93]。當procaspase-12 從胞漿轉(zhuǎn)運至ER時，可被caspase-7活化。除此之外，定位于ER的酪氨酸激酶c-Abl在ER stress時可轉(zhuǎn)運至線粒體，進而導致細胞色素C的釋放。c-Abl缺陷型細胞的ER stress相關(guān)性細胞凋亡被減弱[94]。4.2 外源性凋亡途徑在ER stress條件下，IRE1 與TRAF2 及ASK1 形成異源三聚體，進而活化c-Jun 氨基末端激酶（JNK），誘導細胞凋亡[95]。此外，JIK可與IRE1結(jié)合并促進TRAF2 的磷酸和及其與IRE1 的結(jié)合[96]。

圖 2 IRE1 結(jié)構(gòu)及誘餌質(zhì)粒構(gòu)建示意圖2.2 誘餌蛋白轉(zhuǎn)化酵母rid System 3 & Libraries UserManu 3p 培養(yǎng)基中擴增，后參照Yeas與自激活檢測參照 Matchmaker GAL4 Two-Hybal(PT 247-1)，以 PEG/LiAc 法小規(guī)模轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒入 AH109 酵母菌株，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于SD/-Trp/X-α-Gal平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3-5 d,等待克隆長出，根據(jù)克隆的大小和顏色判斷誘餌蛋白對酵母的毒性及自激活作用。2.3 酵母蛋白提取物的制備及Western blot檢測挑取上述轉(zhuǎn)化平板上的單個白色克隆于 SD/-Trt Protocols Handbook(Clontech PT3024-1)，使用尿素/SDS 法制備酵母蛋白提取物。將所提取的蛋白各取 30 μg，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色 3 min 觀察轉(zhuǎn)膜效果。將轉(zhuǎn)好的膜放入含有 5 mL/LTween-20 的 PBST 中，洗膜 5 min；然后封入含有 50 g/L 脫脂奶的暗盒中，室溫緩慢搖動 60 min；PBST 洗膜 5 min×3 次，加入的按 1:2000 稀釋于 PBST

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本文編號：2749749