【摘要】： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白需肌醇酶1(IRE1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)的核心感受器,可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)未折疊蛋白的聚集并將這種刺激傳遞至細(xì)胞其他區(qū)域。近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種肝臟疾病有關(guān),如病毒感染(乙肝、丙肝),糖尿病-肥胖癥相關(guān)的肝臟疾病,酒精性肝病,α1-抗胰蛋白酶缺乏癥及缺血再灌注損傷等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response,UPR)可通過(guò)誘導(dǎo)分子伴侶表達(dá)上調(diào),關(guān)閉蛋白翻譯等降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白負(fù)荷,但持續(xù)過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系,本研究通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與IRE1相互作用的蛋白質(zhì),為進(jìn)一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝臟疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。 1.酵母雙雜交系統(tǒng)篩選IRE1相互作用蛋白質(zhì):采用酵母雙雜交的方法,分別以hIRE1α(人IRE1α)N端段1～465位氨基酸及C端段468～977位氨基酸為誘餌,與人睪丸cDNA文庫(kù)質(zhì)粒順序轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株,經(jīng)三重/四重營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基及X-α-GAL半乳糖苷酶試驗(yàn)篩選,將PCR鑒定為陽(yáng)性的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,提取質(zhì)粒并測(cè)序,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。最后通過(guò)酵母回轉(zhuǎn)雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)獲得的相互作用加以驗(yàn)證。結(jié)果:成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-IRE1N及pGBKT7-IRE1C,并在酵母中正確表達(dá)融合蛋白,自激活檢測(cè)及毒性檢測(cè)均為陰性。分別篩選出8個(gè)及15個(gè)與IRE1相互作用的蛋白質(zhì);通過(guò)回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,確定了能與IRE1 C端段相互作用的蛋白質(zhì)RACK1。RACK1是由SCOTIN基因編碼的支架蛋白,可細(xì)胞內(nèi)多種激酶相互作用,介導(dǎo)激酶與底物的結(jié)合。 2.驗(yàn)證IRE1與RACK1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞及體外的相互作用:(1)構(gòu)建真核表達(dá)載體3XFLAG-IRE1C, GFPC3-RACK1,雙酶切及測(cè)序鑒定正確,以GFPC3空載體作為對(duì)照,共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證IRE1與RACK1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相互作用。( 2 )構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6p2-RACK1,pGEX-6p1-IRE1C,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)并純化,其中以precision酶切GST-RACK1融合蛋白,獲得不帶GST TAG的RACK1蛋白,與空GST蛋白為對(duì)照,分別與GST-IRE1C孵育,體外Pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IRE1與RACK1的相互作用。(3)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒GFPC3-IRE1WT,轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2,同時(shí)以RACK1單抗及抗鼠-Rodamine為二抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測(cè)IRE1及RACK1在肝細(xì)胞中的定位。結(jié)果:通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證IRE1與RACK1相互作用的存在,且證明IRE1 C端為RACK1結(jié)合部位,免疫熒光證實(shí)IRE1與RACK1在肝細(xì)胞內(nèi)有共定位,為其相互作用提供可靠依據(jù)。 3.RNA干擾實(shí)驗(yàn)探討RACK1對(duì)IRE1功能的影響:(1)轉(zhuǎn)染RACK1 SiRNA入HepG2細(xì)胞,48小時(shí)后收取細(xì)胞裂解液,進(jìn)行Western blot驗(yàn)證基因敲除效果。給予敲除RACK1的細(xì)胞以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)藥物衣霉素(Thapsigargin,TG)處理,通過(guò)western blot檢測(cè)IRE1的磷酸化及其下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)XBP-1 mRNA的表達(dá)及其剪切,確定RACK1敲除對(duì)IRE1功能的影響。(2)相同方法敲除HepG2細(xì)胞中RACK1的表達(dá),給予不同劑量的TG處理,TUNEL法檢測(cè)RACK1敲除對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)肝細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:成功敲除HepG2細(xì)胞中RACK1的表達(dá),Western blot及RT-PCR證實(shí)RACK1敲除可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)IRE1的功能活化,同時(shí)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)肝細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。 結(jié)論:本研究通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)IRE1與RACK1的相互作用,并通過(guò)體內(nèi)、體外多種方法證實(shí)其相互作用的存在,最后通過(guò)RNA干擾及功能試驗(yàn)證實(shí)IRE1對(duì)ER stress的感受及活化,對(duì)分子伴侶的誘導(dǎo)及XBP-1的剪切,以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo),均依賴于RACK1的存在,提示RACK1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路中不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié),與ER stress下肝細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),進(jìn)一步的研究對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的肝臟疾病有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575
【圖文】：

圖 1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜信號(hào)蛋白及主要通路4. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞凋亡ESR 對(duì) ER 穩(wěn)態(tài)的重建體現(xiàn)了它的細(xì)胞保護(hù)作用，然而持續(xù)、過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激導(dǎo)致 ER 功能紊亂無(wú)法被糾正時(shí)，多細(xì)胞真核生物則啟動(dòng)凋亡信號(hào)，清除受損的細(xì)胞，防止應(yīng)激損傷進(jìn)一步擴(kuò)大。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡與傳統(tǒng)的外源性/內(nèi)源性凋亡通路均有交叉，且存在其特異性的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如 caspase-12，以下詳述。4.1 內(nèi)源性凋亡途徑ER stress時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Bak及Bax構(gòu)象發(fā)生改變并且/或二聚化導(dǎo)致ER 鈣離子釋放[85]。ER 鈣庫(kù)的波動(dòng)導(dǎo)致胞漿內(nèi)calpain的活化，進(jìn)而切割pro-caspase-12 生成caspase-12�；罨腸aspase-12 通過(guò)caspase-9 及caspase-3[86-87]激活caspase cascade。這一通路與傳統(tǒng)內(nèi)源性凋亡途徑的Apaf-1 及線粒體細(xì)胞色素c的釋放無(wú)關(guān)，為ER stress特異的獨(dú)立凋亡通

stress誘導(dǎo)凋亡有部分抵抗作用[90-91]，提示caspase-12 與chop介導(dǎo)ERstress特異性的細(xì)胞凋亡。ER stress時(shí)IRE1 的活化可募集TRAF2，而TRAF2 促進(jìn)procasp se-12聚集a[92]，這是procaspase-12 活化必不可少的條件。ER stress上調(diào)procaspase-12 的 表 達(dá) ， 實(shí) 驗(yàn) 證 實(shí) ， caspase-12 過(guò) 表 達(dá) 可 活 化procaspase-12[93]。當(dāng)procaspase-12 從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至ER時(shí)，可被caspase-7活化。除此之外，定位于ER的酪氨酸激酶c-Abl在ER stress時(shí)可轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放。c-Abl缺陷型細(xì)胞的ER stress相關(guān)性細(xì)胞凋亡被減弱[94]。4.2 外源性凋亡途徑在ER stress條件下，IRE1 與TRAF2 及ASK1 形成異源三聚體，進(jìn)而活化c-Jun 氨基末端激酶（JNK），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[95]。此外，JIK可與IRE1結(jié)合并促進(jìn)TRAF2 的磷酸和及其與IRE1 的結(jié)合[96]。

圖 2 IRE1 結(jié)構(gòu)及誘餌質(zhì)粒構(gòu)建示意圖2.2 誘餌蛋白轉(zhuǎn)化酵母rid System 3 & Libraries UserManu 3p 培養(yǎng)基中擴(kuò)增，后參照Yeas與自激活檢測(cè)參照 Matchmaker GAL4 Two-Hybal(PT 247-1)，以 PEG/LiAc 法小規(guī)模轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒入 AH109 酵母菌株，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于SD/-Trp/X-α-Gal平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3-5 d,等待克隆長(zhǎng)出，根據(jù)克隆的大小和顏色判斷誘餌蛋白對(duì)酵母的毒性及自激活作用。2.3 酵母蛋白提取物的制備及Western blot檢測(cè)挑取上述轉(zhuǎn)化平板上的單個(gè)白色克隆于 SD/-Trt Protocols Handbook(Clontech PT3024-1)，使用尿素/SDS 法制備酵母蛋白提取物。將所提取的蛋白各取 30 μg，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色 3 min 觀察轉(zhuǎn)膜效果。將轉(zhuǎn)好的膜放入含有 5 mL/LTween-20 的 PBST 中，洗膜 5 min；然后封入含有 50 g/L 脫脂奶的暗盒中，室溫緩慢搖動(dòng) 60 min；PBST 洗膜 5 min×3 次，加入的按 1:2000 稀釋于 PBST

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本文編號(hào)：2749749