【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外病毒、藥物、酒精等因素，主要特征為肝細胞內(nèi)的脂肪過度沉積，發(fā)生脂肪變性的病理綜合征。NAFLD與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關，是獲得性代謝應激性肝損傷相關疾病。NAFLD包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關肝纖維化等系列疾病譜。它的發(fā)病機制較為復雜，目前主要學說為“二次打擊”理論[1]�，F(xiàn)有研究和本課題組以往研究均提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與NAFLD發(fā)病過程，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的因素有很多,但相關調(diào)控機制尚不明確。此外，NAFLD病程進程中，肝細胞會發(fā)生凋亡等病理改變，其發(fā)生機制也不明確[2]。 磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇選蛋白(Phosphofurin Acidic Cluster Sortingprotein，PACS)家族是多功能蛋白家族，其成員包括PACS-1和PACS-2[3]。PACS-1定位于高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間[4]，而PACS-2則定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間，分別參與調(diào)節(jié)相應細胞器的結構與功能聯(lián)系[5]。其中，PACS-2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體相關膜(Mitochondria-Associated Membrane，MAM)，在調(diào)控細胞凋亡，鈣粒子轉(zhuǎn)運和脂質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。然而，PACS-2在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的表達及意義尚并不明確，因此我們研究了PACS-2在非酒精性脂肪性肝病中的表達變化，并初步探討其可能作用。 方法 1. HepG2肝細胞脂肪變模型 使用a-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)HepG2細胞至匯合度80%以上。建模前一天，換無胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。對照組細胞：a-MEM加1%牛血清白蛋白(不含脂肪酸）培養(yǎng)基處理(0h組)。脂肪變細胞：a-MEM加1%牛血清白蛋白(不含脂肪酸）培養(yǎng)基處理，添加500μM/L(微摩爾/升)的軟脂酸鈉。脂肪變模型根據(jù)誘導時間分為4h,8h,12h和24h等時間點。采用油紅O染色顯示胞內(nèi)脂滴，顯微鏡觀察細胞脂肪變程度[1]。 2. NAFLD大鼠模型 選用4周齡雄性SD大鼠42只(體重170 210g),隨機分為基礎飼料組(對照組)、高脂飼料組(模型組)，分別于喂養(yǎng)分別于4周,8周,12周,16周,20周，每個時相點各收集大鼠6只采集標本。大鼠稱重并麻醉，留取肝組織標本，部分制成石蠟切片，行HE染色；部分-70℃儲存用于western blot檢測。 3. Real-time PCR試驗 Real-time PCR檢測脂肪變HepG2細胞中PACS-2及其所調(diào)控的相關分子的mRNA水平表達，包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose Regulated Protein78, GRP78)、細胞凋亡標志蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2Associated X Protein，Bax)和含半胱氨酸的冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase-3)。 4. Western-blot試驗 Western-blot檢測脂肪變HepG2細胞和NAFLD大鼠肝組織中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3的蛋白表達水平。 5.統(tǒng)計學分析 利用SPSS軟件13.0進行統(tǒng)計分析，以P0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。 結果 1.軟脂酸誘導HepG2細胞發(fā)生脂肪變性 我們采用油紅O染色檢測HepG2細胞脂肪變性程度。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，油紅O染色使脂滴呈現(xiàn)為紅色。軟脂酸處理時間延長, HepG2細胞胞漿內(nèi)脂滴明顯增多,且脂滴呈現(xiàn)逐漸增大，相互融合的現(xiàn)象。這些結果表明，軟脂酸處理HepG2細胞可以誘導肝細胞發(fā)生脂肪變性。 2.高脂飲食導致SD大鼠發(fā)生NAFLD 大鼠肝組織切片，HE染色發(fā)現(xiàn)，隨著高脂飲食時間延長，大鼠肝組織逐漸出現(xiàn)脂肪變。隨喂養(yǎng)時間延長，大鼠肝組織進行性加重，出現(xiàn)肝小葉內(nèi)炎癥及肝纖維化等病理改變。這些結果表明，高脂飲食成功建立了NAFLD大鼠模型。 3. Real-timePCR檢測脂肪變HepG2細胞中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3mRNA的表達水平 Real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)，PACS-2mRNA相對表達量在細胞脂肪變性的早期下降(4h，P0.01；8h，P0.05)，而后期則顯著增加(12h，P0.01；24h， P0.01)。細胞脂肪變性后12h和24h，GRP78、Bax和Caspase-3三者mRNA的相對表達量比未發(fā)生脂肪變性的細胞均顯著升高(三者P0.01)。 4. Western-blot檢測脂肪變HepG2細胞與NAFLD大鼠肝組織中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3的蛋白表達變化 Western-blot檢測表明，與未發(fā)生脂肪變性的細胞比，HepG2細胞脂肪變性4h后PACS-2表達顯著下調(diào)(P0.01)，而脂肪變性12h和24h后則顯著上升。此外，細胞脂肪變性后12h和24h，GRP78、Bax和Caspase-3三者表達量均顯著上調(diào)(P0.01)。 在高脂飲食誘導大鼠NAFLD過程中，早期(8w）PACS-2表達顯著降低(P0.01)，而晚期(16W、20W)則顯著上升(P0.01)。GRP78在早期(8w)即表現(xiàn)為顯著上調(diào)(P0.01)，之后持續(xù)升高, Bax和Caspase-3則在晚期(16w、20w)才出現(xiàn)有顯著上調(diào)(P0.01)。 結論 1.無論在細胞模型或動物模型，肝細胞脂肪變性過程中PACS-2表達動態(tài)變化，規(guī)律是早期表達降低，后期表達升高；GRP78表達在早期即升高并持續(xù)高表達, Bax和Caspase-3則只有到后期才出現(xiàn)顯著升高。 2.肝細胞脂肪變早期出現(xiàn)PACS-2低表達可能參與了NAFLD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，其在晚期升高可能與肝細胞凋亡所致肝損傷相關。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5
【圖文】：

圖 1-1 0hHepG2 細胞中未見明顯脂滴。油紅 O 染色 (x400)圖 1-2 4h少數(shù)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)直徑較小的脂滴。圖 1-3 8h較多的細胞出現(xiàn)較多脂滴，在細胞內(nèi)脂滴直徑也較前有所增大。油紅 O 染色 (x400)圖 1-4 12h更多的細胞脂肪變，一些細胞中的脂滴增大，并相互融合。油紅 O 染色 (x400)

圖 1-1 0hHepG2 細胞中未見明顯脂滴。油紅 O 染色 (x400)圖 1-2 4h少數(shù)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)直徑較小的脂滴。圖 1-3 8h較多的細胞出現(xiàn)較多脂滴，在細胞內(nèi)脂滴直徑也較前有所增大。油紅 O 染色 (x400)圖 1-4 12h更多的細胞脂肪變，一些細胞中的脂滴增大，并相互融合。油紅 O 染色 (x400)

圖 1-3 8h較多的細胞出現(xiàn)較多脂滴，在細胞內(nèi)脂滴直徑也較前有所增大。油紅 O 染色 (x400)圖 1-4 12h更多的細胞脂肪變，一些細胞中的脂滴增大并相互融合。油紅 O 染色 (x400)圖 1-5 24h幾乎所有細胞都有明顯的脂滴，部分有融合。油紅 O 染色 (x400)

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 王春華;陳東風;;線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開放與NAFLD大鼠肝細胞凋亡的關系[J];重慶醫(yī)學;2007年08期

2 閔敏;陳東風;王軍;艾正琳;樊麗琳;嚴麗麗;;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在大鼠非酒精性脂肪性肝炎中的表達及意義[J];第三軍醫(yī)大學學報;2009年01期

3 熊吉;王軍;樊麗琳;胡輅;蘭春慧;楊敏;孫文靜;陳東風;;Sigma-1受體在非酒精性脂肪性肝病中的表達及意義[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年08期

4 史洪濤,陳東風,李陶,熊仁平;Caspase 3在大鼠非酒精性脂肪肝形成中的作用[J];中華消化雜志;2005年03期

本文編號：2746318