【摘要】：第一章IL-10處理的樹突狀細胞分泌的EXOSOMES的制備與鑒定 目的探討體外誘導和擴增大鼠骨髓來源樹突狀細胞,經(jīng)IL-10處理后,分離純化其分泌的exosomes(IL-10-EXO)的方法,并從形態(tài)學、分子表型和免疫學功能等方面對IL-10-EXO予以鑒定。 方法無菌條件下獲取Wistar大鼠骨髓前體細胞,在GM-CSF(5ng/ml)條件下進行體外誘導、擴增,隔日半量換液,第5天收獲未成熟DC細胞(imDC),與IL-10(10ng/ml)共培養(yǎng)48h,獲得IL-10處理的樹突狀細胞(IL-10-DC)。通過倒置顯微鏡觀察其細胞形態(tài),流式細胞儀檢測細胞表面分子表達情況。在此基礎上,收集IL-10-DC培養(yǎng)上清,超速離心法分離獲得IL-10-EXO,膜超濾離心法純化除菌。透射電鏡觀察IL-10-Dex形態(tài),流式細胞儀檢測IL-10-Dex膜表面分子表達情況,混合淋巴細胞反應(MLR)進行IL-10-EXO功能學檢測。 結果電鏡下觀察IL-10-DC細胞表面可見細小樹突狀突起,呈現(xiàn)未成熟特征。流式細胞儀檢測表明imDC低表達MHCII、CD80、CD86及CD40分子。超速離心IL-10-DC培養(yǎng)上清可分離獲得IL-10-Dex。膜超濾離心純化除菌后透射電鏡下觀察可見IL-10-EXO為直徑介于50-100nm,具有典型脂質雙分子層結構的小囊泡。流式細胞儀檢測表明IL-10-EXO低表達MHCII分子,低表達或不表達CD80、CD86及CD40分子。MLR檢測顯示IL-10-EXO在imDC的輔助下刺激T淋巴細胞增殖的能力顯著低于imDC分泌的exosomes(EXO)。 結論本法是體外制備大鼠骨髓來源IL-10-DC分泌的exosomes的有效方法,獲得的IL-10-EXO低表達MHCII、CD80、CD86及CD40分子,具有抑制炎癥反應的作用。 第二章IL-10處理的樹突狀細胞分泌的exosomes對TNBS聯(lián)合酒精誘導實驗性大鼠腸炎的治療作用 目的探討IL-10處理的樹突狀細胞分泌的exosomes對TNBS酒精聯(lián)合誘導的實驗性大鼠腸炎的治療作用,并嘗試闡述其機制。 方法雄性Wistar大鼠40只,分為4組,n=10,灌腸之前禁食2天,不禁水。A組對照組10只給予45%酒精灌腸;其它30只TNBS聯(lián)合45%酒精灌腸3天后,按照下述不同處理方法分為3組:B組腹腔注射1ml生理鹽水;C組腹腔注射含有10μg IL-10-EXO的1ml生理鹽水;D組腹腔注射含有10μg EXO的1ml生理鹽水。觀察7天內(nèi)的情況,第8天全部處死。記錄統(tǒng)計腸炎活動度評分、結腸肉眼評分、結腸組織病理評分,檢測結腸組織中的髓過氧化物酶(MPO)活性和細胞因子INF-γ、IL-2、TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10等水平。 結果A組大鼠腸炎癥狀持續(xù)時間短暫,很快自愈;C組大鼠腸炎活動度評分、結腸肉眼評分和結腸組織病理評分均較B、D兩組有顯著的降低,結腸組織中的MPO水平,促炎癥因子INF-γ、IL-2、TNF-α的水平亦較低,抑炎癥因子IL-10水平較高。 結論TNBS聯(lián)合酒精灌腸可以誘導出較理想的實驗性大鼠腸炎;IL-10處理DC分泌的IL-10-EXO能有效抑制大鼠腸炎的炎癥反應,降低Th1型細胞因子的表達水平,改善腸炎癥狀。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R574
【圖文】：

結 果1.光鏡下imDC、IL-10-DC及mDC的形態(tài)學觀察在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況。如圖1-1所示，培養(yǎng)第5天，imDC細胞集落明顯增多、增大，呈團塊狀或葡萄串狀。IL-10處理后，見IL-10-DC細胞呈圓形、均勻分布，樹突狀分支細小。LPS刺激成熟后，mDC細胞懸浮增多，樹突狀分支增加，變得更加粗大?

圖1-1：光鏡下觀察imDC、IL-10-DC及mDC形態(tài)（×20）2.電鏡下imDC、IL-10-DC及mDC形態(tài)學觀察如圖1-2所示，掃描電鏡觀察顯示培養(yǎng)5天的imDC及IL-10-DC細胞表面可見23

表達水平進一步降低，具有更強的誘導耐受、抑制炎癥的能力。在本實驗中，我們檢測了mDC、imDC及IL-10-DC表面分子的表達水平。IL-10-DC細胞表面分子MHCⅡ、共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達均較低，如圖1-3所示，呈現(xiàn)典型的致耐受性DC的表型特征。25

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 涂頻;張新華;周曉軍;;血管形成因子和炎性腸病相關性的研究進展[J];醫(yī)學研究生學報;2007年11期

2 魏曉為;李寧;朱維銘;;腫瘤壞死因子受體與炎性腸病發(fā)病機制研究進展[J];醫(yī)學研究生學報;2009年04期

3 劉袁媛;范華驊;任亞娜;楊潔;聶曉絢;趙麗華;林俊杰;;小鼠調(diào)節(jié)性樹突狀細胞分泌的外泌體誘導免疫耐受的實驗研究[J];中國實驗血液學雜志;2008年02期

4 李為民;劉巍;高成;周保國;王政;張瑞宏;孔一慧;李悅;韓薇;甘潤韜;薛洪杰;耿建強;楊樹森;邵群;張美;;白細胞介素-10基因修飾的未成熟樹突狀細胞誘導自身免疫性心肌炎特異性耐受的實驗研究[J];中華心血管病雜志;2006年08期

5 ;Activation of nuclear factor-kappa B and effects of pyrrolidine dithiocarbamate on TNBS-induced rat colitis[J];World Journal of Gastroenterology;2005年10期

6 ;Preventive and therapeutic effects of NF-kappaB inhibitor curcumin in rats colitis induced by trinitrobenzene sulfonic: acid[J];World Journal of Gastroenterology;2005年12期

7 Alfredo José Lucendo;Livia Cristina De Rezende;;Importance of nutrition in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2009年17期

本文編號：2745835