【摘要】： 對(duì)大多數(shù)在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的病毒來(lái)說(shuō),病毒RNA輸出(RNA export)是其基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要步驟之一。1993年在HBV基因組上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)片段(1151nt-1684nt)被定義為乙型肝炎病毒(HBV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件PRE(HBV post-transcriptional regulatory element, HPRE)。現(xiàn)有的研究認(rèn)為其具有輔助轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核向細(xì)胞漿運(yùn)輸?shù)墓δ?但機(jī)制尚未清楚。Zang等人用帶電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞蛋白能夠與HPRE相互作用,其中一個(gè)35kDa的蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。但GAPDH如何影響HBV的復(fù)制和表達(dá),目前還沒有具體報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于從體外驗(yàn)證GAPDH與HPRE-RNA的結(jié)合作用,利用檢測(cè)系統(tǒng)pDM138-HPRE探討GAPDH在HPRE轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用,然后過(guò)量表達(dá)GAPDH于HepG2 2.2.15細(xì)胞和瞬時(shí)表達(dá)HBs的細(xì)胞中,檢測(cè)HBs表達(dá)量來(lái)闡明GAPDH在HBV的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制中的功能。 主要研究方法和研究結(jié)果: 1.用線性化pGEM-HPRE質(zhì)粒作為模板,在Biotion標(biāo)記的堿基體系中用T7 RNA聚合酶,以體外轉(zhuǎn)錄的方法合成HPRE-Biotin RNA。在BL21(DE3)細(xì)菌里誘導(dǎo)大量表達(dá)重組體pET32a(+)-GAPDH的GAPDH-His蛋白,獲得大量56KDa的蛋白,再采用Ni2+-NTA樹脂親和純化,以SDS-PAGE進(jìn)行初步鑒定,并以兔抗人GAPDH和抗His標(biāo)簽抗體來(lái)進(jìn)行Western blot蛋白鑒定。 2.利用M-280 Streptavidin磁珠和Biotin的特異性結(jié)合,可用磁力座分離復(fù)合物的特性,將洗滌后的沉淀復(fù)合物做Western Blot鑒定。用抗His和抗GAPDH單克隆抗體檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組GAPDH-His+HPRE-Biotin RNA能形成復(fù)合物,可鑒定出目的蛋白條帶,而對(duì)照組His+HPRE-Biotin RNA則沒有條帶出現(xiàn)。由此證明GAPDH-His蛋白能夠與HPRE RNA結(jié)合。 3.將表達(dá)人類GAPDH基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GAPDH ,與含CAT報(bào)告基因的pDM138及pDM138-HPRE和表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的pEGFP-N1分組共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定pEGFP-N1表達(dá)的GFP,來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。用ELISA方法檢測(cè)報(bào)告基因CAT的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證蛋白GAPDH對(duì)HPRE功能的影響。報(bào)告基因CAT表達(dá)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDM138-HPRE的細(xì)胞CAT表達(dá)明顯增加;而共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDM138-HPRE和pcDNA3.1(+)-GAPDH,CAT的表達(dá)受到明顯抑制(p0.05)。 4.將GAPDH蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GAPDH轉(zhuǎn)染于HepG2 2.2.15細(xì)胞和瞬時(shí)表達(dá)HBs的293T細(xì)胞中,通過(guò)ELISA檢測(cè)HBs的表達(dá)量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:GAPDH蛋白在HepG2 2.2.15中過(guò)度表達(dá)對(duì)HBs的表達(dá)有明顯的抑制作用(p0.05)。通過(guò)對(duì)比pcDNA3.1(+)-HBs與pcDNA3.1(+)-HBs-HPRE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證實(shí)GAPDH蛋白對(duì)HBs表達(dá)的抑制作用是通過(guò)HPRE來(lái)發(fā)揮的。 結(jié)論:GAPDH和HPRE RNA能夠在體外結(jié)合,并且GAPDH是HPRE的抑制性蛋白,能通過(guò)HPRE來(lái)調(diào)節(jié)HBs抗原的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

T32a(+)-GAPDH 重組質(zhì)粒的構(gòu)建。A, M 為 λ-EcoT14 I digest D體pET32a(+)用BamHI和SalI限制性內(nèi)切酶雙酶切結(jié)果；2為PCpET32a(+)-GAPDH 重組質(zhì)粒用 BamHI 和 SalI 限制性內(nèi)切酶雙truction of pET32a(+)-GAPDH plasmid. A, M is λ-EcoT14 I digesestion result of prokaryotic expression vector pET32a(+) with Bact of the GAPDH. B, 1 is double digestion result of pET32a(+)-Gwith BamHI and SalI. 誘導(dǎo)后的重組表達(dá)菌 BL21 菌液離心收集細(xì)菌沉淀后，以白，分管收集得到的重組質(zhì)粒蛋白(圖 1-2A)和對(duì)照蛋白GE 檢測(cè)呈現(xiàn)出特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期值相符。

APDH 重組質(zhì)粒的構(gòu)建。A, M 為 λ-EcoT14 I digesa(+)用BamHI和SalI限制性內(nèi)切酶雙酶切結(jié)果；2為P)-GAPDH 重組質(zhì)粒用 BamHI 和 SalI 限制性內(nèi)切酶f pET32a(+)-GAPDH plasmid. A, M is λ-EcoT14 I digult of prokaryotic expression vector pET32a(+) with BAPDH. B, 1 is double digestion result of pET32a(+)-with BamHI and SalI.重組表達(dá)菌 BL21 菌液離心收集細(xì)菌沉淀后，收集得到的重組質(zhì)粒蛋白(圖 1-2A)和對(duì)照蛋呈現(xiàn)出特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期值相符。

22t 結(jié)果 A, 用抗 His-tag 抗體進(jìn)行 Western白；2 為 Ni2+親和層析柱純化獲得的 His-GPDH 單克隆抗體進(jìn)行 Western btotting 鑒定獲得 His-GAPDH 融合蛋白；3、4 為用 N白。lot analysis. A, Identification with anti-His; M is protein marker. B, Identification wit marker; 1-2 are His-GAPDH protein; 3-4 a Western blot 鑒定結(jié)果”中所介紹獲得生物素標(biāo)記的 HPRE 相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)體系中， 經(jīng)過(guò)磁珠結(jié)合實(shí)blot 方法分析，應(yīng)用抗 His（圖 1-4A）

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本文編號(hào)：2745792