發(fā)布時(shí)間：2020-07-04 13:51

【摘要】：實(shí)驗(yàn)背景 ICC是廣泛分布于胃腸道平滑肌和神經(jīng)叢的一類特殊類型間質(zhì)細(xì)胞。研究證實(shí)其主要功能有[1,2]:1、胃腸道慢波活動的起搏細(xì)胞;2、促進(jìn)電活動的傳導(dǎo);3、介導(dǎo)胃腸神經(jīng)和平滑肌之間信號傳導(dǎo);4、作為牽張感受器協(xié)調(diào)機(jī)械壓力的輸入。 許多胃腸動力障礙性疾病與ICC的異常變化有關(guān)。因此,在胃腸道把ICC作為治療和研究的靶目標(biāo)很有現(xiàn)實(shí)意義。但是體外分離和培養(yǎng)ICC仍存在許多不確定因素,尤其是長期培養(yǎng)ICC的可行性及ICC的生物學(xué)特性等問題仍然不能解釋清楚。有關(guān)ICC的培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇也未見報(bào)道,因此摸索ICC長期培養(yǎng)的條件,了解細(xì)胞生物學(xué)特性,為持續(xù)性研究ICC功能打下基礎(chǔ)。 近來研究顯示在ICC上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十余種類型的受體,包括:膽囊收縮素受體A[3]、G蛋白偶聯(lián)受體(PKA,PKC)[4]、膽堿能(M2,M3)受體[5]、神經(jīng)激肽(NK1 ,NK3)受體[6]、嘌呤能(P2Y1, P2Y4,P2X2, P2X5)受體[7,8]、五羥色胺(5-HT, 5-HT3, 5-HT4)受體[9,10]等。受體的研究對詮釋細(xì)胞功能及新型藥物研發(fā)有重要的指導(dǎo)意義。 胃動素是由22個氨基酸組成的單鏈腦腸肽,主要由十二指腸和空腸黏膜上皮Mo內(nèi)分泌細(xì)胞分泌。其生理作用是來調(diào)節(jié)胃腸移行性運(yùn)動復(fù)合波(MMC)。而胃動素調(diào)節(jié)胃腸活動的機(jī)制一個重要突破口就是胃動素受體的分布及受體后信號通路的研究。根據(jù)目前報(bào)道胃動素受體在不同物種的胃腸平滑肌細(xì)胞和腸神經(jīng)元均有表達(dá)[11,12,13,14,15,16,17,18]。而作為胃腸功能單位神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)中ICC是否會存在胃動素受體表達(dá)?我們先前的關(guān)于ICC在胃動素受體激動劑誘導(dǎo)平滑肌收縮中作用機(jī)制的研究顯示ICC可能存在胃動素受體表達(dá)[19]。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本研究目的就是探討ICC的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇、傳代的條件,了解細(xì)胞的生物學(xué)特性;分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、基因和蛋白水平來驗(yàn)證ICC上是否存在胃動素受體的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)方法 第一部分:以兔小腸為ICC組織來源,應(yīng)用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)ICC;特異的c-kit抗體對ICC進(jìn)行免疫熒光鑒定;對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng);摸索細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的條件;用MTT法測定傳代后細(xì)胞生長曲線。 第二部分:新鮮分離的細(xì)胞和培養(yǎng)15天的細(xì)胞分別進(jìn)行流式細(xì)胞分析c-kit陽性細(xì)胞比率,選用陽性率高的方法進(jìn)行ICC的分選;以流式細(xì)胞儀分選的ICC為靶細(xì)胞,分別采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)。將提取的細(xì)胞總RNA和總蛋白,進(jìn)行分析檢測;應(yīng)用特異性c-kit蛋白抗體、胃動素受體抗體(anti-GPR38)以及細(xì)胞核染料(hoechst33342)對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色;從基因和蛋白水平以及細(xì)胞形態(tài)方面來驗(yàn)證ICC是否表達(dá)胃動素受體。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、普通光鏡和免疫熒光分析證實(shí)成功分離、培養(yǎng)ICC;細(xì)胞傳代達(dá)數(shù)次,且生長狀態(tài)良好;對數(shù)生長期的ICC經(jīng)凍存后復(fù)蘇成功;成功繪制出細(xì)胞生長曲線。 2、比較新鮮分離的細(xì)胞和培養(yǎng)數(shù)日的細(xì)胞流式分析結(jié)果,c-kit陽性細(xì)胞比率。前者為9.8%,后者為19.1%。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)流式分析的陽性細(xì)胞比率高;選用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行流式分選作為細(xì)胞來源。再次流式分析培養(yǎng)的細(xì)胞中c-kit陽性細(xì)胞比率為64.3%,分選出陽性細(xì)胞分別為6.7×105個和5.6×106個;分別對提取ICC的總RNA和總蛋白分析檢測顯示胃動素受體mRNA以及受體蛋白定性分析結(jié)果均為陽性;細(xì)胞免疫熒光三標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示ICC胞膜上存在胃動素受體表達(dá)。 結(jié)論 ICC的成功培養(yǎng)、傳代及凍存復(fù)蘇,為細(xì)胞建系打下基礎(chǔ),也為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了科學(xué)可行的方法指導(dǎo),不但節(jié)省了資源,也必將促進(jìn)ICC研究的深入開展;基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,首次證實(shí)培養(yǎng)的兔腸道ICC上有胃動素受體表達(dá),進(jìn)一步提示ICC可能在胃動素促胃腸動力方面發(fā)揮重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R57
【圖文】：

普通光鏡下培養(yǎng)的細(xì)胞圖1：72h后細(xì)胞在鏡下可見有梭形、紡錘形、三角形，核大，核周胞漿少

前 3d 細(xì)胞生長緩慢，后 3d 逐漸恢復(fù)活力。凍存后免疫熒光鑒定如(圖2C-D) (×200)圖 2 凍存前與復(fù)蘇后鏡下圖圖 2A-B 凍存前的細(xì)胞。2A：普通光鏡下細(xì)胞形態(tài)，2B：相同的細(xì)胞熒光染色后形態(tài)（×200）。圖 2C-D 復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)。2C：光鏡下形態(tài)，2D：熒光染色后的對照觀察（×200）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 劉梅,董蕾,朱文藝;大鼠杏仁核胃動素受體分布及其作用研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年09期

2 楊俠;董蕾;楊浩;;大鼠腸肌間神經(jīng)元胃動素受體的表達(dá)及胃動素引起神經(jīng)元內(nèi)鈣信號的機(jī)制[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年05期

3 趙鵬;韓燕飛;黃旭;王佐妤;陸紅麗;許文燮;;新鮮分離小鼠胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定及其電生理學(xué)特性[J];生物物理學(xué)報(bào);2008年04期

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本文編號：2741195