【摘要】： 前言 肝硬化是威脅人類健康的嚴重疾病，肝纖維化是各種肝病(包括病毒性、酒精性、化學性等)發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)之路。肝纖維化的發(fā)展是細胞外基質(zhì)(ECM)合成增加、降解減少的結(jié)果。肝星狀細胞(HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，HSC是分泌合成膠原的主要細胞。在ECM降解過程中起主要作用的酶類是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)和尿激酶原激活系統(tǒng)(uPA和PAI-1)。HSC激活受多種細胞因子的調(diào)控如腫瘤壞死因子(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β_1(TGF-β_1)、血小板源性生長因子(PDGF)等，其中PDGF是最強的促有絲分裂原，TGF-β_1為最強的促肝纖維化因子。目前普遍認為，在酒精性肝纖維化和肝硬化形成過程中，HSC起重要作用，HSC體外培養(yǎng)成功為肝纖維化的研究提供了理想的細胞模型。中藥復(fù)方的多途徑、多層次、多靶點的綜合藥理作用在抗肝纖維化治療中顯示出獨特的優(yōu)勢。本研究觀察了中藥抗纖復(fù)方Ⅰ號(KXI)對乙醛處理的體外培養(yǎng)的大鼠HSC增殖、膠原合成、MMPs、TIMPs及PAI-1mRNA的表達和TGF-β_1、PDGF分泌的影響，以期闡述KXI抗酒精性肝纖維化的作用機制，為臨床酒精性肝病(ALD)的中藥治療提供更多的理論依據(jù)。 材料與方法 一、主要材料與儀器 (一)動物為Wistar雄性大鼠。Ⅳ型膠原酶、密度梯度離心介質(zhì)Nycodenz、NP-40均為Sigma公司產(chǎn)品，鏈霉蛋白酶為德國Merck公司產(chǎn)品，四 甲基偶氮哩藍（M’IT）為Fluka公司產(chǎn)品，40％乙酸（分析純）購自中國醫(yī)藥 集團上�；瘜W試劑公司，DMEM培養(yǎng)液為美國GeO公司產(chǎn)品。兔抗人結(jié) 蛋白（Deslnin）抗體、SP組化試劑盒購于福建邁新公司，PClll、LN、HA放射 免疫測定試劑盒為上海海軍醫(yī)學研究所產(chǎn)品；RT－PCR試劑盒為hkaa產(chǎn) 品，引物均由北京奧科公司合成。雙抗體夾心ABC－EllSA試劑盒購于上 海森雄科技實業(yè)有限公司。 （二）藥物與藥物血清的制備：抗纖復(fù)方互號（主要由丹參、黃茂、紅花。 漢防己、葛根、桃仁、甘草等藥物組成）濃縮口服制劑和生理鹽水，給大鼠誰 服。無菌條件下由下腔靜脈取血，離心取血清。使用時用無血清 DMEM培 養(yǎng)液稀釋成10％的藥物和正常血清孵育液。 （三）酶標儀E－Uza Mat－300：美國產(chǎn)JC－12ho放射免疫Y順儀： 中國產(chǎn)；w’n－100 PCR擴增儀：美國產(chǎn)；ID Kodak成像分析系統(tǒng)：美國產(chǎn)； 穩(wěn)壓電泳儀 POWER／NPACJ00：BIO－RAD產(chǎn)品。 二、方法 （一）肝星狀細胞分離、培養(yǎng)和鑒定 參照宋少剛等報道的方法分離肝星狀細胞。采用鏈霉蛋白酶及IV型 膠原酶對大鼠肝臟進行原位灌流消化，經(jīng)比揚他以d用E密度梯度離心，吸 取界面處的細胞懸浮于20％小牛血清DMEM培養(yǎng)液中，以IX10VInl的濃 度接種在塑料培養(yǎng)M里，置CO。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本次實驗采用傳2－4代 HSC。HSC鑒定方法：將細胞爬片用兔抗人Desndn抗體、SP法作免疫細胞 化學染色，胞漿陽染者為HSC。 （二）細胞增殖率測定 采用Mrt比色法，傳代的細胞長滿單層后用胰酶消化后置20％小牛血 清 DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞數(shù)為 IX10＊L，以每孔 100gi加人96孔培養(yǎng) 板內(nèi)，置 CO。培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)72h后，分成正常血清對照組、正常血清十乙 醛組及藥物血清十乙醛組。每孔100J10％藥物血清孵育液，再加人乙醛 使之終濃度分別為 100w上00uM300uM。對照血清十乙酸組以同樣方法 添加正常血清及乙醛。每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，作用 24b后，加人 W液 20葉，用酶標儀測其OD值。 （三）放免法測定nlll、LN、HA含量 以 IX10＊瓶濃度接種在培養(yǎng)瓶（25Cm2）中的 HSC長滿單層后，分為正 ·2· 常血清對照組、正常血清十乙醛組及藥物血清十乙醛組。乙醛組加人乙醛 后使終濃度為二見剛，血清濃度為10％，培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清，每個樣 品作雙復(fù)管，嚴格按說明操作。JC－1200放射免疫Y計數(shù)儀上直接測定 PClll、LN、HA含量，取均值。 （四）ELISA法檢測TGF ＊；和PDGF含量 按方法（三）處理HSC及收集培養(yǎng)上清，每個樣品均作復(fù)管，嚴格按說 明操作。酶標儀檢測OD值。 （五）RT一PCR檢測al（I）、al（IV）型膠原，MMP一1、2、9，TIMP一1、2 和 PAI人 表達 按方法（三）處理HSC 6h和24h，分另提取總RNA并測定RNA濃度和 純度。2 pgRNA經(jīng) BcaBEST Polylnerase逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。引物參照文獻設(shè) 計，p－achn作為內(nèi)參照，PCR擴增條件及產(chǎn)物各有不同（詳見論文部分人 PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳、攝片、密度掃描，然后用其表達量與對應(yīng) p－achn的表達量進行比較。 （六）統(tǒng)計學處理 各組數(shù)據(jù)以均值上標準差k。S）表示，兩兩均數(shù)的比較用t檢驗。 實驗結(jié)果 （一）培養(yǎng)大鼠HSCS的鑒定 免疫細胞化學染色顯示，傳代＊SC純度＞98％。（見圖1－1） （二）乙醛及藥物血清對HSC增殖的影響 正常血清濃度為10％時，乙醛濃度為100pM在00pMJ00pM時均對 ＊SC有增殖作用汗＜o．05人但各濃度間差異無統(tǒng)計學意義，而10％藥物血 清只對100pM乙醒刺
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R575.2
【圖文】：

經(jīng)臺盼藍染色細胞存活率90%以上。2)免疫細胞化學染色顯示，傳代HSC純度>98%。(見圖1一l)3)HSC形態(tài)學觀察:剛分離接種的HScs在倒置顯微鏡下為折光性很強的圓球，遠小于肝細胞，原代培養(yǎng)24h后，細胞即貼壁，呈扁圓形，少量開始伸展，培養(yǎng)至3一5天細胞貼壁生長良好，大多數(shù)細胞伸出偽足，呈現(xiàn)梭性、多邊形和星形狀，胞質(zhì)中脂滴明顯。培養(yǎng)7d時，細胞開始融合形成特有的放射狀排列，經(jīng)過10一14d的原代培養(yǎng)，細胞分裂、增殖，由局灶性生長至長成單層，胞質(zhì)中脂滴不明顯，細胞面積明顯增大，此時細胞呈現(xiàn)典型的成纖維細胞樣形態(tài)，傳代后細胞保持典型的成纖維細胞形態(tài)不變。2.乙醛及藥物血清對HSC形態(tài)和生長的影響在乙醛濃度為100一300林M及正常血清和藥物血清濃度為10%范圍內(nèi)，各藥物組及對照組細胞生長狀態(tài)良好，其形態(tài)無明顯改變。3.乙醛及藥物血清對HSC增殖的影響正常血清濃度為10%時，乙醛濃度為100林M(0.1836士0.O225vs

4.乙醛及藥物血清對HSCS中TIMP一1mRNA表達的影響100卜M乙醛能明顯增強HSC中TIMP一lmRNA的表達，10%藥物血清能抑制其促進作用。(見圖2一4)篡口對照.乙醛口藥物山虎.呀，﨑IQ

本文編號：2740760