【摘要】：背景非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為全球最常見的慢性肝病,然而其確切發(fā)病機(jī)制仍未明確,非侵入性特異標(biāo)記物仍未找到,特效藥物仍未研發(fā)。研究表明,作為表觀遺傳學(xué)重要組成部分的miRNA在NAFLD發(fā)生發(fā)展、診斷及治療中有著重要意義,特別是外泌體miRNA受到了磷脂雙層結(jié)構(gòu)保護(hù)而較游離miRNA穩(wěn)定性更好,但迄今為止人血外泌體miRNA在NAFLD中差異表達(dá)譜及作用特點(diǎn)研究尚少。目的篩選NAFLD患者血清外泌體miRNA差異表達(dá)譜,研究脂肪肝患者血清外泌體與動(dòng)物模型肝組織miRNA表達(dá)異同,并進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析,初步探索miRNA在NAFLD發(fā)生發(fā)展、診斷及治療中的意義。方法(1)各取4例人口學(xué)特征相近的中重度NAFLD和健康人血清行外泌體提取及鑒定,Illumina高通量測(cè)序篩選出miRNA差異表達(dá)譜,對(duì)差異表達(dá)最顯著的4條miRNA按輕度NAFLD、中重度NAFLD和Control每組各20例行qRT-PCR驗(yàn)證。(2)高脂飼料(HFD)喂養(yǎng)C57 BL/6小鼠構(gòu)建NAFLD動(dòng)物模型,分別于4周、8周、12周留取HFD組和CTL組小鼠血和肝臟標(biāo)本,行血生化、肝臟病理及以上4條miRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。(3)對(duì)以上4條miRNA取TargetScan、miRanda、Mireap靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果交集與miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果進(jìn)行并集作為最終預(yù)測(cè)結(jié)果,并進(jìn)行靶基因的GO(Gene Ontology)分析和基于KEGG的pathway富集分析。結(jié)果(1)初步篩選出NAFLD和Control具有顯著性差異(P0.05)且差異表達(dá)在2倍以上血清外泌體miRNA共19條,其中上調(diào)8條,下調(diào)11條。(2)hsa-miR-122-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-197-3p 相對(duì)表達(dá)量:NAFLD 中重度組NAFLD輕度組Control 組;hsa-miR-483-3p 相對(duì)表達(dá)量:NAFLD 組(輕度/中重度)Control 組,NAFLD輕度組與中重度組間無(wú)顯著性差異。(3)高脂飼料喂養(yǎng)8周小鼠部分肝細(xì)胞出現(xiàn)散在脂肪滴,喂養(yǎng)12周出現(xiàn)彌漫性脂肪變,呈以小泡性為主的混合性脂肪變性。(4)喂養(yǎng)12周時(shí)小鼠肝組織miRNA相對(duì)表達(dá)量:mmu-miR-122-5p(HFD組CTL組),mmu-miR-146b-5p(HFD 組CTL組),mmu-miR-483-3p 無(wú)顯著性差異。(5)4條miRNA行靶基因預(yù)測(cè)共得到2623個(gè)靶基因;GO功能分析顯示靶基因在分子功能、細(xì)胞組分、生物過程有廣泛的注釋;靶基因顯著富集的pathway共84條,從20條與NAFLD最密切的通路中篩選出與至少10條通路都相關(guān)的靶基因共5個(gè),即PIK3R2,AKT2,AKT3,MAPK1,NFKB1。結(jié)論(1)血清外泌體 hsa-miR-122-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-483-3p在鑒定NAFLD與健康人群中意義不同,均參與脂肪代謝和多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。(2)高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠12周可構(gòu)建成熟的NAFLD模型。(3)mmu-miR-122-5p、mmu-miR-146b-5p在小鼠肝臟脂肪變性過程中可能起重要作用。(4)這4條miRNA有望作為無(wú)創(chuàng)診斷NAFLD的生物標(biāo)志物和特異性治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575
【圖文】：

米顆粒跟蹤分析（ＮＴＡ）法進(jìn)行外泌體粒徑檢測(cè)逡逑米顆粒跟蹤分析（ＮＴＡ）結(jié)果顯示：外泌體的濃度為３．２９ｅ＋００８邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／值為６７邋ｎｍ，平均粒徑為８５．０６邋ｎｍ，ＳＤ為３６．８９邋ｎｍ，粒徑在３０－１５０邋ｎｍ有顆粒的８８．６７％，符合外泌體的大小分布。見圖２。逡逑８．０Ｅ＋０６邋■逡逑７．０Ｅ４０６邋？邐６７逡逑ｔ邐Ａ逡逑、？邐６．０Ｅ４Ｏ６邋＊逡逑ｉ邐５．０Ｅ４０６邋■邐｜｜逡逑Ｉ逡逑＾邋４．０Ｅ４Ｏ６邋■逡逑Ｉ逡逑Ｃ邋３．０Ｅ＋０６邋■邐Ｉ邋Ｉ逡逑ｌ邐＼逡逑§邐２．０Ｅ＋０６邋■邐（邐＼逡逑１．０Ｅ＋０６邋■邐Ｉ逡逑ＯＯＥ－＾Ｏ邋邐４邐Ｚ邐６邐＾邐ｈ邐５—逡逑＂

納米顆粒跟蹤分析（ＮＴＡ）結(jié)果顯示：外泌體的濃度為３．２９ｅ＋００８邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ，逡逑粒徑峰值為６７邋ｎｍ，平均粒徑為８５．０６邋ｎｍ，ＳＤ為３６．８９邋ｎｍ，粒徑在３０－１５０邋ｎｍ的顆逡逑粒占所有顆粒的８８．６７％，符合外泌體的大小分布。見圖２。逡逑８．０Ｅ＋０６邋■逡逑７．０Ｅ４０６邋？邐６７逡逑ｔ邐Ａ逡逑、？邐６．０Ｅ４Ｏ６邋＊逡逑ｉ邐５．０Ｅ４０６邋■邐｜｜逡逑Ｉ逡逑＾邋４．０Ｅ４Ｏ６邋■逡逑Ｉ逡逑Ｃ邋３．０Ｅ＋０６邋■邐Ｉ邋Ｉ逡逑ｌ邐＼逡逑§邐２．０Ｅ＋０６邋■邐（邐＼逡逑１．０Ｅ＋０６邋■邐Ｉ逡逑ＯＯＥ－＾Ｏ邋邐４邐Ｚ邐６邐＾邐ｈ邐５—逡逑—邐—邐＜Ｎ＜Ｎｍｍ＂ＴＴｆ逡逑Ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋（ｎｍ）逡逑圖２外泌體的粒徑分布逡逑２．邋３蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體標(biāo)記蛋白

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