【摘要】：乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的主要公共衛(wèi)生問題，慢性感染者超過3.6億。HBV慢性感染是肝硬化（LC）和肝細(xì)胞癌（HCC）的主要危險(xiǎn)因素。HBV在感染早期，尤其是在乙肝e抗原（HBeAg）陽性階段，免疫選擇較弱，病毒基因組以“野生序列”為主，隨年齡增長，免疫選擇增強(qiáng)，常導(dǎo)致HBeAg轉(zhuǎn)換，病毒變異頻率逐漸增加，尤其是在“慢性活動(dòng)性乙肝-肝硬化-HCC”動(dòng)態(tài)過程中逐漸形成了HCC相關(guān)HBV變異。 乙肝病毒屬嗜肝DNA病毒，全長約3.2kb，由部分雙鏈的松弛環(huán)狀DNA組成，包含C、S、X、P四個(gè)開放閱讀框，以往關(guān)于HBV的研究大多局限于某一基因片段，或是將多個(gè)區(qū)段重新拼接獲得HBV全基因組序列，此方法有很大局限性。另外由于在我國人群感染的HBV是以B和C基因型為主，與其他基因型相比在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的時(shí)間、疾病進(jìn)展、預(yù)后及對(duì)干擾素治療反應(yīng)有不同的影響，而現(xiàn)存HBV野生序列多是用國外流行株全序列。因此我們首先建立我國HBV流行株的野生序列，建立HBV變異研究的基礎(chǔ)工作，并進(jìn)一步分析病毒變異與HBV相關(guān)肝病的關(guān)系。 另外，自從PCR擴(kuò)增DNA技術(shù)推廣以來，研究HBV基因組異質(zhì)性及其致病機(jī)制和病毒蛋白表達(dá)成為嗜肝病毒研究重點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)HBV前C區(qū)變異可導(dǎo)致HBeAg無法正常合成。表面抗原（HBsAg）免疫表位決定簇突變可誘導(dǎo)中和抗體的逃避，從而逃避免疫清除。在HBV基因組其他調(diào)控區(qū)的變異也多次被發(fā)現(xiàn)。然而大多數(shù)病毒變異致病機(jī)制及其生物功能和臨床特征尚不明確。因此進(jìn)行病毒體外研究是HBV研究的重要方面，但目前缺乏有效的HBV體外感染模型，極大地限制了HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄機(jī)制和抗病毒等方面的研究。而且目前關(guān)于HBV編碼蛋白功能的研究多是單組分研究，HBV全基因組病毒變異對(duì)宿主的整體影響鮮見報(bào)道。建立HBV全基因組感染細(xì)胞株是從整體水平研究HBV致病機(jī)制的重要途徑。我們擬構(gòu)建C基因型的野生型及變異型HBV全基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，并通過比較其復(fù)制表達(dá)水平，探討病毒變異功能。 研究目的 建立HBV B和C基因型野生型全基因組序列，并在此基礎(chǔ)上分析病毒突變與HBV相關(guān)肝病的聯(lián)系，建立體外HBV野生型和變異型全長轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，進(jìn)一步分析病毒突變對(duì)HBV復(fù)制表達(dá)的影響。 研究方法 分析了HBV B和C基因型694例HBeAg陽性的無癥狀表面抗原攜帶者（ASCs）,200例慢性乙型肝炎（CHB）患者，180例肝硬化患者和313例肝癌患者。ASC患者B和C基因型每個(gè)核苷酸位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高的堿基被列為野生型，在此基礎(chǔ)上共篩選出193個(gè)突變“熱點(diǎn)”。多因素回歸分析進(jìn)一步確定了與肝硬化和肝癌獨(dú)立相關(guān)的病毒突變。并建立HBV感染肝癌細(xì)胞株，進(jìn)一步評(píng)價(jià)病毒突變功能。 研究結(jié)果 1.獲得HBV B和C基因型全基因組野生序列。比較所有樣本，HCC患者平均年齡較老，而且男性比例和基因型C比例均高于其他組。 2. LC和ASC,CHB之和比較， G1613A,C1653T，A1703G,G1719T,A1762T/G1764A, T1978C,A1979G,C2288A, T2857C,T2943G,C3000T, PreS2起始密碼子突變，PreS1缺失可增加LC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn), T1758C,A109T,T705C可降低加LC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；HCC和ASC,CHB，LC比較， C1653T，A1762T/G1764A, A1846T,G1896A,G1899A,C1969T,G2104A,A2189C,C2354A, A3012C, A3097C, T531C,T636A,T796G,PreS2起始密碼子突變可增加HCC的HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；G1634H, G2011M， A162G,T705C可降低HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。 3.多因素回歸分析表明，年齡大、男性、A1762T/G1764A、G1613A、 C3000T、preS2起始密碼子突變是LC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素, T705是可降低LC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；年齡大、A1762T/G1764A、 G1896A, G1899A, preS2起始密碼子突變是HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 4.單倍型研究表明大多數(shù)包含兩個(gè)或兩個(gè)以上突變位點(diǎn)的單倍型均和HCC顯著相關(guān)。與HCC相關(guān)的突變位點(diǎn)中G1896A，G1899A，preS2起始密碼子突變特異度較高，A1762T/G1764A有比較合適的敏感度和特異度。這些突變位點(diǎn)，無論是單獨(dú)存在還是與其他變異組合都可以被HBV感染者作為HCC的指示標(biāo)志。 5.體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和Hep3B2.1-7細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),野生型和包含不同變異組合的變異型HBV全長對(duì)病毒復(fù)制表達(dá)水平影響各異，變異型HBV-mt-4（變異組合為T1674C+T1753G+A1762T/G1764A+C1766T+G1896A+T3046C+A3150G+G3191A+T126C+preS2deletion(nt.1-55)+preS2start codon mutation+A162G+C928T+G957A+T2426A+T2498C），比其他變異型HBV在preS區(qū)多T3046C+A3150G+G3191A(F1016+S1050G+S1064N)三種突變，其HBsAg表達(dá)量最低；轉(zhuǎn)染變異型HBV-mt-5（T1674G+A1762T/G1764A+G1896A+C3116T+preS2start codon mutation+A162G+A895T+G915A+T929A+C940A+A984G+A993G+C1075T+A1221T+G1230C+T1290G+G1317A+A1319C+C1347A+G1386A+C1480A+T1556A+C2444T+A2571G+A2590T+A2631G+C2651T+C2660T+G2699A+C2732T++G2741A+T2768G），在P區(qū)與其他變異型HBV相比多A895T+T929A++C940A+C1075T+G1230C+C1480A+T1556A+C2444T+A2574G+A2590T+2651T+C2660T+G2699A+C2732T++G2741A+T2768G (Q299K+L310Q+Q314K+R410Q+K494T++V519G+S815L+L858S+M864L+S884F+T887I+R900H+S911L+G914D+L923R)，少C928T+G957A+T2426A+T2498C (L310Q+L319I+I809N+L833P)，但DNA復(fù)制情況各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。只有野生型HBV轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)HBeAg為陽性，其余變異型均為陰性。 結(jié)論 1.基因型C中A1762T/G1764A，G1613A， C3000T，PreS2起始密碼子突變是LC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素, T705是LC的保護(hù)因素； A1762T/G1764A， G1896A， G1899A, preS2起始密碼子突變是HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。C3000T和T705是新發(fā)現(xiàn)的與LC獨(dú)立相關(guān)的因素。 2.不同的HBV變異組合對(duì)肝癌細(xì)胞病毒復(fù)制表達(dá)影響各異，位于preS區(qū)的病毒突變T3046C-A3150G-G3191A組合可能通過影響preS區(qū)功能區(qū)結(jié)合位點(diǎn)影響HBsAg表達(dá)，前C區(qū)G1896A突變阻止HBeAg合成，也可減少DNA復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62

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3 秦h覬

本文編號(hào)：2737977