【摘要】：背景和目的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常見的慢性肝病之一,在全球范圍內(nèi)的平均患病率為26%。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變,NAFLD呈現(xiàn)出低齡化趨勢,且在肥胖或胰島素抵抗人群中更為普遍,現(xiàn)已成為兒童和青少年慢性肝臟疾病最常見的原因。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),NAFLD在我國中重度肥胖青少年中的發(fā)病率達(dá)30.14-49.85%。肥胖、糖尿病和NAFLD等代謝性疾病的廣泛流行給人們帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型與人類疾病進(jìn)展的因果關(guān)系密切,是NAFLD病理研究中應(yīng)用最為廣泛的模型。本研究通過建立NAFLD小鼠模型,檢測其體重、生化指標(biāo)及肝臟病理學(xué)改變,動態(tài)觀察高脂飲食誘導(dǎo)下幼年和成年小鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展的演變過程:通過基因表達(dá)譜芯片檢測小鼠肝臟脂代相關(guān)基因的mRNA表達(dá),探究脂代謝異常與幼年小鼠早期脂肪肝發(fā)病的關(guān)系;通過RT-PCR進(jìn)一步檢測炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá),探討炎癥反應(yīng)參與幼年和成年小鼠NAFLD的潛在機制,為NAFLD發(fā)病機制的研究及治療提供理論依據(jù)和研究平臺。方法1.6周齡野生型C57BL/6J小鼠,雌性20只,雄性5只。適應(yīng)性喂2周后,將8周齡雌性小鼠與雄性小鼠合籠交配。斷乳后(3周齡)的雄性小鼠為實驗對象,隨機分為以下3組:(1)HF-Y組(高脂飲食幼年組):小鼠3周齡斷乳后給予高脂飲食(40%脂肪,2%果糖,2%膽固醇);(2)HF-A組(高脂飲食成年組):小鼠斷乳后正常飲食(10%脂肪)喂養(yǎng)至8周齡后給予高脂飲食:(3)NC組(正常飲食組):小鼠斷乳后給予正常飲食,并持續(xù)喂養(yǎng)至實驗終點。2.每周監(jiān)測小鼠的體重,分別于高脂飲食喂養(yǎng)的2、4、12、16、20和25周進(jìn)行心臟取血后處死小鼠,留取肝臟標(biāo)本。利用全自動生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。利用膽固醇熒光測定試劑盒檢測總膽固醇(TC),甘油三酯比色測定試劑盒測定甘油三酯(TG)。禁食10小時后,行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT),尾靜脈取血測定小鼠血糖。3.處死小鼠后立即取出肝臟,液氮速凍,-80 ℃保存。經(jīng)過固定液固定,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察肝臟組織形態(tài)。CD45抗體、F4/80抗體和Collagen 1 alpha 1抗體的免疫組化染色評價小鼠肝臟炎癥和纖維化。4.分別取高脂喂養(yǎng)0和2周的HF-Y組和HF-A組肝臟標(biāo)本,基因表達(dá)譜芯片檢測肝臟中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),具體包括:ATP結(jié)合盒亞族A成員1(ABCA1)、ATP結(jié)合盒子亞族G成員(ABCG1)、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT1)、甾醇O-�；D(zhuǎn)移酶2(SOAT2)、極長鏈特異性�；o酶A脫氫酶(ACADVL)、脂肪分化相關(guān)蛋白(ADFP)、載脂蛋白E(APOE)、花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX12)、花生四烯酸15-脂氧合酶(ALOX15)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)、血小板糖蛋白4(CD36)、固醇26-羥化酶(CYP27A1)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)、脂肪酸去飽和酶1(FADS1)、脂肪酸去飽和酶2(FADS2)、脂肪酸去飽和酶3(FADS3)、甘油激酶(GYK)、3-羥-3甲基戊二酰-CoA還原酶(HMGCR)、3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGCS1)、線粒體三功能酶β亞基(HADHB)、胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、低密度脂蛋白(LDLR)、白三烯A4水解酶(LTA4H)、白三烯C4合成酶(LTC4S)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、羥甾醇受體LXRα(NR1H3)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2(PLA2G4A)、過氧化物酶增殖激活受體δ(PPARD)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白7(SLC16A6)、長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1(SLC27A1)、長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白3(SLC27A3)、固醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)、固醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子2(SREBF2)、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白4(STARD4)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)、血栓素A合成酶(TBXAS1)、腫瘤壞死因子(TNF)、解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的mRNA表達(dá)。RT-PCR重復(fù)驗證基因表達(dá)譜芯片擴增結(jié)果較好的基因。5.分別取高脂飲食喂養(yǎng)16和20周的HF-Y組和HF-A組肝臟標(biāo)本,RT-PCR檢測肝臟中炎癥相關(guān)基因的表達(dá),具體包括:白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-α(INF-α)、干擾素-β(INF-β)的mRNA表達(dá)。結(jié)果1.體重:0-4周,HF-Y組體重增長速率高于HF-A組;4周后,HF-Y組體重增長速率減低,與HF-A組基本一致。3-13周,同周齡的HF-Y組體重高于HF-A組;13-25周,同周齡的HF-A組體重高于HF-Y組。相同周齡下,HF-Y組和HF-A組體重高于NC組(P0.05)。2.肝功能:2周,HF-Y組ALT顯著高于HF-A組(P0.05)。4周,HF-Y組ALT較2周時明顯降低,與HF-A組基本一致。4周后,兩組ALT水平逐漸升高:25周,HF-A組ALT顯著高于HF-Y組(P0.05)。0-12周,HF-A組和HF-Y組AST無顯著差異(P0.05);16周,HF-A組AST顯著高于HF-Y組(P0.05);20周起,與HF-Y組相比,HF-A組AST有升高趨勢,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.血脂:2周,HF-Y組TG顯著高于HF-A組(P0.05)。4周,與HF-A組相比,HF-Y組TG有升高趨勢,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。12-25周,HF-Y組和HF-A組TG無顯著差異(P0.05)。0-16周,HF-A組和HF-Y組TC無顯著差異(P0.05)。20周,兩組TC較16周顯著升高;與HF-Y組相比,HF-A組TC有升高趨勢,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.IPGTT:20周,糖耐量結(jié)果顯示,HF-Y組和HF-A組各時間點血糖顯著高于NC組(P0.05)。HF-Y和HF-A組糖耐量曲線下面積(AUC)顯著高于NC組(P0.05)。與HF-Y組相比,HF-A組AUC有升高趨勢,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.肝臟病理結(jié)果:2周,HF-Y組肝臟較0周發(fā)生明顯脂肪變性。4周,HF-Y組肝臟脂肪浸潤改善,與HF-A組肝臟脂肪變性程度基本一致。16和20周,兩組肝臟均呈現(xiàn)彌漫性脂變;與HF-Y組相比,HF-A組出現(xiàn)嚴(yán)重的大泡型脂肪變,伴炎癥浸潤和纖維化。6.脂代謝相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果:高脂飲食喂養(yǎng)2周,與HF-A組相比,HF-Y組LPL、FABP5、UCP2、TBXAS1的mRNA表達(dá)上調(diào)(P0.05),ALOX12的mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05)。7.炎癥相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果:與HF-A組相比,高脂飲食喂養(yǎng)16周,HF-Y組TNF-α的mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05);高脂飲食喂養(yǎng)20周,HF-Y組IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05)。結(jié)論1.幼年小鼠高脂飲食初期生長迅速,伴發(fā)脂肪肝;至喂養(yǎng)中后期,對慢性脂質(zhì)應(yīng)激的耐受性增強。成年小鼠早期NAFLD進(jìn)展緩慢;至喂養(yǎng)中后期,脂肪肝較幼年小鼠更為嚴(yán)重。2.LPL、FABP5、UCP2、TBXAS1和ALOX12等脂代謝相關(guān)基因可能參與幼年小鼠NAFLD的早期發(fā)病。3.幼年小鼠脂肪性肝炎進(jìn)展緩慢可能與炎癥相關(guān)基因IL-6和TNF-α的表達(dá)減低有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.5
【圖文】：

圖３．１．丨ＨＦ－Ｙ組和ＨＦ－Ａ組體重隨ＨＦＤ時間的變化逡逑年齡下比較各組小鼠體重：與ＮＣ組相比，ＨＦ－Ｙ組和丨丨Ｆ－Ａ組生長周，同周齡的ＨＦ－Ｙ組體重高于ＨＦ－Ａ組；１３－２５周，同周齡的ＨＦ于ＨＦ－Ｙ組（尸＜０．０５）（圖３．１．２）。逡逑４５－１逡逑｜邋Ｉ逡逑Ｉ邐：邋ｒ逡逑ｌｏ－ｊ逡逑＾邐４邋６邋８邋１０邋１２邋１４邋１６邋１８邋２０邋２２邋２４逡逑Ａｇｅ邋（ｗｅｅｋｓ）逡逑圖３．１．２各組體承隨年齡的變化逡逑功能逡逑

第一部分ＮＡＦＬＤ小鼠體重，生化指標(biāo)及肝臟病理改變５０－１逡逑－５＊邐１５－邋＾邐＋邋ＨＦ－Ａ逡逑Ｍ邐１０－＾邐■０？邋ＨＦ－Ｙ逡逑５－逡逑０邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑０邋２邋４邋６邋８邋１０邋１２邋１４邋１６邋１８２０邋２２邋２４逡逑Ｔｉｍｅ邋（Ｗｅｅｋｓ）逡逑圖３．１．丨ＨＦ－Ｙ組和ＨＦ－Ａ組體重隨ＨＦＤ時間的變化逡逑同年齡下比較各組小鼠體重：與ＮＣ組相比，ＨＦ－Ｙ組和丨丨Ｆ－Ａ組生長３周，同周齡的ＨＦ－Ｙ組體重高于ＨＦ－Ａ組；１３－２５周，同周齡的ＨＦ－高于ＨＦ－Ｙ組（尸＜０．０５）（圖３．１．２）。逡逑４５－１逡逑

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9 袁衡;張U

本文編號：2737361