【摘要】： 目的慢性乙型肝炎患者外周血中含有大量乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)的表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg),每毫升血清中HBsAg的水平通常在數(shù)千至數(shù)萬國際單位。但在臨床上也可發(fā)現(xiàn),少部分慢性HBV感染者的血清HBsAg水平較低,即使存在HBV的復(fù)制(HBV DNA≥10~4拷貝/ml),其HBsAg水平仍低于250IU/ml。本文主要探討慢性HBV感染者低血清HBsAg水平的發(fā)生機(jī)制。 材料與方法HBV標(biāo)志物的檢測采用雅培公司試劑,在雅培公司ARCHITECT i2000SR儀器上進(jìn)行。HBV DNA檢測采用達(dá)安公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。 通過分析1783例慢性HBV感染者血清標(biāo)本HBV標(biāo)志物的檢測結(jié)果,收集HBsAg水平低于250IU/ml的血清標(biāo)本與生化學(xué)、HBV DNA及臨床資料。采用酚/氯仿方法抽提血清中的HBV DNA,并對(duì)HBV S基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。對(duì)其中4例出現(xiàn)S基因變異的血清標(biāo)本,進(jìn)行全基因擴(kuò)增并測序,從而得到血清HBV全基因序列。 將4例標(biāo)本的全基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆及測序,與血清中HBV全基因序列進(jìn)行比較,挑選出代表優(yōu)勢株的克隆。將HBV優(yōu)勢株的小S蛋白基因克隆至pXF3H真核表達(dá)載體,在小S蛋白的氨基端加入HA標(biāo)簽蛋白。將該表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染Huh7及Hela細(xì)胞,用ARCHITECT HBsAg QT方法檢測上清液HBsAg的水平。用針對(duì)HA的抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),檢測細(xì)胞內(nèi)及上清液中含HA標(biāo)簽蛋白的HBsAg表達(dá)量。 結(jié)果在1783份標(biāo)本中,HBsAg水平低于250IU/ml且HBVDNA大于1X10~4拷貝/ml的患者35例。故HBsAg水平低于250IU/ml且HBVDNA大于1X10~4拷貝/ml發(fā)生率為1.87%。通過分析16例HBsAg水平患者的HBVS基因區(qū)氨基酸序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有15例患者的HBV S基因氨基酸序列發(fā)生了變異,其中報(bào)道較多的位點(diǎn)包括:sT120T,sT/I126N,sQ129/N,sG130/R,sT131N,sM133T。少有報(bào)道的位點(diǎn)為:sN40S,sI68T,sC76Y,sL95W,sV96G,sL98V,sS117T,sA157D,sW196L,sF220L。發(fā)現(xiàn)S13患者S區(qū)的啟動(dòng)子(nt2976-3174)缺失,在15個(gè)克隆中,有13個(gè)克隆存在此區(qū)域的缺失。S15患者HBV S基因的第220位核苷酸堿基由T變?yōu)锳,使S基因22位密碼子由亮氨酸(UUA)變?yōu)榻K止密碼子(UAG)。對(duì)4例患者的HBV的全基因進(jìn)行了擴(kuò)增,成功克隆了HBV全基因。 將S11(含有sQ129/N變異位點(diǎn))和S14(含有sT/I126N及sT131N變異位點(diǎn))的優(yōu)勢株小S基因克隆至pXF3H質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)上清中HBsAg水平較野毒株水平低2-4倍,但用針對(duì)HA抗體進(jìn)行免疫印跡檢測,發(fā)現(xiàn)這兩例患者HBV優(yōu)勢株的HBsAg的表達(dá)量較野毒株明顯增加,糖基化HBsAg的比例明顯增多,而細(xì)胞裂解液中HBsAg表達(dá)量也顯著增加。用針對(duì)小S蛋白多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡檢測,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解液中HBsAg不能被檢測出來。 結(jié)論大多數(shù)慢性HBV感染者(90%以上)的血清HBsAg水平在250IU/ml以上。在HBV DNA大于1X10~4拷貝/ml慢性HBV感染者中,低于250IU/ml的患者占1.87%。HBV S基因區(qū)某些氨基酸的變異是造成低HBsAg水平的主要因素。S基因區(qū)氨基酸變異引起低HBsAg水平的機(jī)制主要是S基因區(qū)某些氨基酸變異為天門冬酰胺(asparagine,即N)后,容易使HBsAg糖基化,小S蛋白過度糖基化將影響其空間構(gòu)型,進(jìn)而影響其抗原性,造成其檢測水平的降低,而HBsAg的表達(dá)并未受到影響,2例患者HBV優(yōu)勢株的HBsAg的表達(dá)顯著增加。其它機(jī)制還包括S基因啟動(dòng)子的缺失和出現(xiàn)終止變異等。總之,多種機(jī)制導(dǎo)致了某些慢性HBV感染患者血清中呈現(xiàn)低HBsAg水平。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

8)將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50一100貝洗脫液EB，室溫放置Zmin， 12000r/min離心lmin將質(zhì)粒收集在離心管中。抽提質(zhì)粒后，同樣用Sacl在37℃酶切3h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定(見圖1一l)。獷又年、、勺、、%、孕令令牽小中3000bp2000bP1000bp圖1一1將全基因克隆質(zhì)粒以sacl酶切鑒定，酶切后載體片段長度約為2700bp，HBV基因組片段長度約為32O0bp。

Germany研究機(jī)構(gòu)的陸蒙吉教授饋贈(zèng)，該質(zhì)粒從PRKS質(zhì)粒改造得來，為真核表達(dá)載體，上游包括CMV啟動(dòng)子，HBsAg基因是用EcoRI和Psil酶切克隆到載體上，在HBsAg的N端連接HA蛋白標(biāo)簽(見圖2一1)。同時(shí)還饋贈(zèng)含野毒株s區(qū)和含sT123N變異的S區(qū)的pXF3H質(zhì)粒。pEGFp一N3質(zhì)粒(購于美國Clonteeh公司)。1O6卜-曰圖2一1為pxF3H質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)圖， HAtag連接在HBsAg的N端，在EcoRI和Pstl酶切位點(diǎn)之間接入HBsAg。2.細(xì)胞系人肝癌細(xì)胞系Huh7保存于液氮中，復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%的胎牛血清，ZmM

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