發(fā)布時間：2020-06-28 04:59

【摘要】：目的:P2X7受體是一種ATP介導(dǎo)的門控離子通道,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。P2X7受體的活化可以導(dǎo)致NLRP3炎性小體的組裝并最終導(dǎo)致IL-1β的釋放。我們前期研究發(fā)現(xiàn),P2X7R-NLRP3信號通路的活化能導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞胞外基質(zhì)沉積,促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程,但目前P2X7R-NLRP3信號通路在酒精性脂肪性肝炎中的作用仍不清楚。因此本研究的目的是通過沉默或抑制P2X7受體探討P2X7R-NLRP3信號通路對酒精性肝臟脂肪性肝炎中肝臟脂肪蓄積和炎癥的作用及機(jī)制。方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)首先使用C57BL/6小鼠通過酒精灌胃和慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃分別建立急、慢性酒精性肝損傷模型,然后選擇急性酒精性肝損傷模型分別使用P2X7R的選擇性抑制劑A438079或者P2X7R SiRNA造成小鼠P2X7R抑制或沉默,觀察P2X7R在酒精性脂肪性肝炎的作用;并使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體耗竭小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞,觀察酒精性脂肪性肝炎中巨噬細(xì)胞對肝臟脂肪蓄積的影響。1)急性酒精性肝損傷模型:小鼠隨機(jī)分為5組,正常組和末次酒精灌胃后4、12、24和48小時處死組,每組5只小鼠。酒精灌胃小鼠每12小時給與5 g/kg酒精灌胃一次,共3次,末次酒精灌胃后在相對應(yīng)時間進(jìn)行處死,正常組與4小時組一同處死,取肝臟和血液隨后檢測血清中ALT、TG、IL-1β以及肝臟組織中TG的含量并通過HE染色和F4/80免疫熒光染色小鼠肝臟脂肪蓄積和巨噬細(xì)胞募集情況,通過Q-PCR檢測小鼠肝臟組織中Fasn、Scd1、CXCL1和CXCL2的mRNA水平。2)慢性酒精性肝損傷模型:小鼠隨機(jī)分為兩組,對照組和酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃組(下文簡稱酒精組),每組6只小鼠。模型的建立過程如下:酒精組給與酒精含量逐天增加1%(V/V)的液體Lieber-DeCarli飼料,待液體酒精含量達(dá)5%(V/V)后,持續(xù)喂養(yǎng)10天,第11天給與5 g/kg的酒精灌胃一次;對照組給與對照飼料,并且根據(jù)酒精含量的變化加入同等熱量的麥芽糖糊精,酒精組小鼠酒精灌胃時正常組小鼠則同時給與等熱量的麥芽糖糊精灌胃;酒精灌胃后9小時,對小鼠進(jìn)行乙醚麻醉,并取血和肝臟,通過Q-PCR檢測小鼠肝臟組織中SREBP1的靶基因Fasn、Scd1、Acly以及PPARα的靶基因Cd36、Cpt2和P2x7r、Nlp3 Cxcl1、Cxcl2、Prkαα1、Sk11的mRNA水平。3)急性酒精性肝損傷加A438079模型:小鼠隨機(jī)分為正常組、酒精組及酒精加A438079組,每組5只小鼠。酒精模型的建立同急性酒精性肝損傷模型,酒精加A438079組在酒精灌胃后30分鐘后皮下注射A438079(30mg/kg),末次酒精灌胃后4小時處死所有小鼠,存留血清及肝臟,隨后檢測血清中ALT、TG及肝臟中TG的含量;通過QPCR檢測IL-1β、Fasn、Scd1、CXCL1和CXCL2的mRNA水平;通過HE染色、尼羅紅染色和油紅O染色觀察小鼠肝臟組織脂肪蓄積情況;通過F4/80免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞募集情況;通過免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠肝臟組織中SREBP1和HMGB1的表達(dá)情況。4)急性酒精性肝損傷加P2X7R SiRNA模型:小鼠隨機(jī)分為7組,分別為正常組、對照組、P2X7RSiRNA64、65組、酒精組及酒精加P2X7RSiRNA64、65組。SiRNA組將SiRNA(7.5 nmol)經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),48小時后進(jìn)行第2次尾靜脈注射,然后1小時后對三組酒精組的小鼠進(jìn)行酒精灌胃造成急性酒精性肝損傷模型,隨后檢測血清中ALT、TG及肝臟中TG的含量;通過HE染色、尼羅紅染色和油紅O染色觀察小鼠肝臟組織脂肪蓄積情況;通過免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠肝臟組織中SREBP1和HMGB1的表達(dá)情況;通過QPCR檢測IL-1β、Fasn、Scd1、Acly和Cpt2的 mRNA 水平。5)巨噬細(xì)胞耗竭模型:小鼠隨機(jī)分為4組(n=6),分別為PBS脂質(zhì)體組,氯膦酸鹽脂質(zhì)體組,PBS脂質(zhì)體加乙醇組以及氯膦酸鹽脂質(zhì)體加乙醇組。通過小鼠尾靜脈將150μLPBS脂質(zhì)體或氯膦酸鹽脂質(zhì)體注入小鼠體內(nèi)。末次注射后48小時,建立急性酒精性肝損傷模型,取小鼠肝臟,通過F4/80熒光染色檢測巨噬細(xì)胞耗竭情況,通過HE或尼羅紅染色實(shí)驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞耗竭對酒精灌胃造成的肝臟脂肪蓄積的影響。2.體外實(shí)驗(yàn)部分使用酒精或者LPS/ATP對小鼠原代肝細(xì)胞、HepG2或HepG2-ADH1細(xì)胞進(jìn)行刺激,觀察A438079或P2X7R SiRNA對肝細(xì)胞脂肪變性或炎癥反應(yīng)的作用。1)通過膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),并分別使用酒精或者LPS/ATP對其進(jìn)行刺激,通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察小鼠原代肝細(xì)胞中SREBP1的表達(dá)情況,通過油紅O染色實(shí)驗(yàn)觀察小鼠原代肝細(xì)胞中脂肪蓄積情況并通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察IL-1β及HMGB1的表達(dá)情況;2)酒精或者LPS/ATP對小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行刺激同時P2X7R的選擇性抑制劑A438079、TLR4抑制劑CLI-095及Caspase1抑制劑Ⅳ,使用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察Caspase1、ASC、IL-1β以及HMGB1的表達(dá)情況;3)使用不同濃度的酒精對分別對HepG2以及HepG2-ADH1細(xì)胞進(jìn)行刺激,使用免疫熒光染色方法觀察HMGB1的表達(dá)及位置,并提取HepG2-ADH1細(xì)胞的總蛋白、漿蛋白以及核蛋白,并濃縮上清,使用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察HMGB1在各組分中的表達(dá)情況。4)使用酒精對HepG2細(xì)胞進(jìn)行刺激,并同時給與A438079及Caspase1抑制劑IV,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察SREBP1的表達(dá)情況,并提取蛋白通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測不同處理下LKBI、AMPK以及P-LKB1和P-AMPK表達(dá)的變化。結(jié)果:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,急慢性酒精性肝損傷模型中均出現(xiàn)小鼠肝臟脂肪蓄積和炎癥相關(guān)因子表達(dá);急性酒精性肝損傷模型中,末次酒精灌胃4小時后小鼠肝臟脂肪蓄積最為明顯;慢性P2X7R選擇性抑制劑A438079和P2X7R SiRNA對P2X7R的抑制或沉默均可以減少小鼠血清中ALT、TG以及肝臟組織中TG的含量,下調(diào)SREBP1的表達(dá),減少小鼠肝臟中的脂肪蓄積并下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、HMGB1等表達(dá)水平;另外A438079給與后酒精造成的小鼠肝臟中巨噬細(xì)胞的募集以及HMGB1由細(xì)胞核向細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)移得到抑制;P2X7R SiRNA減少P2X7R在小鼠肝臟中的表達(dá),降低了SREBP1靶基因Fasn、Scd1、Acly并上調(diào)PPARα的靶基因Cpt2的表達(dá);巨噬細(xì)胞的耗竭可以緩解酒精暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟中的脂肪蓄積。2.體外實(shí)驗(yàn)中,ETOH或LPS/ATP的刺激均可以造成肝細(xì)胞中脂肪沉積,升高小鼠原代肝細(xì)胞中SREBP1和IL-1β的表達(dá)水平;A438079、TLR4抑制劑CLI-095及Caspase1抑制劑IV可以減少P2X7R-NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,減少IL-1β的表達(dá)及釋放;酒精性濃度依賴性的造成HepG2及HepG2-ADH1中HMGB1由細(xì)胞核向細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)移:另外酒精暴露導(dǎo)致的HepG2中LKB1-AMPK的抑制,在給與A438079和Caspase1抑制劑IV后得到恢復(fù)。結(jié)論:P2X7受體的抑制或沉默通過阻斷P2X7R-NLRP3信號軸減少肝臟脂肪積累和IL-1β以及其他炎性因子的釋放從而減少ASH過程中的脂肪變性和炎癥反應(yīng);肝細(xì)胞中存在依賴于P2X7R-NLRP3的IL-1β釋放途徑;尋找P2X7R-NLRP3炎性小體信號通路的安全有效的抑制劑是治療ASH一項(xiàng)新選擇。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.1
【圖文】：

圖２．邋ＮＬＲＰ３炎性體組裝的示意圖

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本文編號：2732584