【摘要】：目的:P2X7受體是一種ATP介導的門控離子通道,在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。P2X7受體的活化可以導致NLRP3炎性小體的組裝并最終導致IL-1β的釋放。我們前期研究發(fā)現,P2X7R-NLRP3信號通路的活化能導致肝星狀細胞胞外基質沉積,促進肝纖維化的進程,但目前P2X7R-NLRP3信號通路在酒精性脂肪性肝炎中的作用仍不清楚。因此本研究的目的是通過沉默或抑制P2X7受體探討P2X7R-NLRP3信號通路對酒精性肝臟脂肪性肝炎中肝臟脂肪蓄積和炎癥的作用及機制。方法:1.體內實驗首先使用C57BL/6小鼠通過酒精灌胃和慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃分別建立急、慢性酒精性肝損傷模型,然后選擇急性酒精性肝損傷模型分別使用P2X7R的選擇性抑制劑A438079或者P2X7R SiRNA造成小鼠P2X7R抑制或沉默,觀察P2X7R在酒精性脂肪性肝炎的作用;并使用氯膦酸鹽脂質體耗竭小鼠體內巨噬細胞,觀察酒精性脂肪性肝炎中巨噬細胞對肝臟脂肪蓄積的影響。1)急性酒精性肝損傷模型:小鼠隨機分為5組,正常組和末次酒精灌胃后4、12、24和48小時處死組,每組5只小鼠。酒精灌胃小鼠每12小時給與5 g/kg酒精灌胃一次,共3次,末次酒精灌胃后在相對應時間進行處死,正常組與4小時組一同處死,取肝臟和血液隨后檢測血清中ALT、TG、IL-1β以及肝臟組織中TG的含量并通過HE染色和F4/80免疫熒光染色小鼠肝臟脂肪蓄積和巨噬細胞募集情況,通過Q-PCR檢測小鼠肝臟組織中Fasn、Scd1、CXCL1和CXCL2的mRNA水平。2)慢性酒精性肝損傷模型:小鼠隨機分為兩組,對照組和酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃組(下文簡稱酒精組),每組6只小鼠。模型的建立過程如下:酒精組給與酒精含量逐天增加1%(V/V)的液體Lieber-DeCarli飼料,待液體酒精含量達5%(V/V)后,持續(xù)喂養(yǎng)10天,第11天給與5 g/kg的酒精灌胃一次;對照組給與對照飼料,并且根據酒精含量的變化加入同等熱量的麥芽糖糊精,酒精組小鼠酒精灌胃時正常組小鼠則同時給與等熱量的麥芽糖糊精灌胃;酒精灌胃后9小時,對小鼠進行乙醚麻醉,并取血和肝臟,通過Q-PCR檢測小鼠肝臟組織中SREBP1的靶基因Fasn、Scd1、Acly以及PPARα的靶基因Cd36、Cpt2和P2x7r、Nlp3 Cxcl1、Cxcl2、Prkαα1、Sk11的mRNA水平。3)急性酒精性肝損傷加A438079模型:小鼠隨機分為正常組、酒精組及酒精加A438079組,每組5只小鼠。酒精模型的建立同急性酒精性肝損傷模型,酒精加A438079組在酒精灌胃后30分鐘后皮下注射A438079(30mg/kg),末次酒精灌胃后4小時處死所有小鼠,存留血清及肝臟,隨后檢測血清中ALT、TG及肝臟中TG的含量;通過QPCR檢測IL-1β、Fasn、Scd1、CXCL1和CXCL2的mRNA水平;通過HE染色、尼羅紅染色和油紅O染色觀察小鼠肝臟組織脂肪蓄積情況;通過F4/80免疫熒光實驗觀察巨噬細胞募集情況;通過免疫組織化學染色觀察小鼠肝臟組織中SREBP1和HMGB1的表達情況。4)急性酒精性肝損傷加P2X7R SiRNA模型:小鼠隨機分為7組,分別為正常組、對照組、P2X7RSiRNA64、65組、酒精組及酒精加P2X7RSiRNA64、65組。SiRNA組將SiRNA(7.5 nmol)經尾靜脈注射入小鼠體內,48小時后進行第2次尾靜脈注射,然后1小時后對三組酒精組的小鼠進行酒精灌胃造成急性酒精性肝損傷模型,隨后檢測血清中ALT、TG及肝臟中TG的含量;通過HE染色、尼羅紅染色和油紅O染色觀察小鼠肝臟組織脂肪蓄積情況;通過免疫組織化學染色觀察小鼠肝臟組織中SREBP1和HMGB1的表達情況;通過QPCR檢測IL-1β、Fasn、Scd1、Acly和Cpt2的 mRNA 水平。5)巨噬細胞耗竭模型:小鼠隨機分為4組(n=6),分別為PBS脂質體組,氯膦酸鹽脂質體組,PBS脂質體加乙醇組以及氯膦酸鹽脂質體加乙醇組。通過小鼠尾靜脈將150μLPBS脂質體或氯膦酸鹽脂質體注入小鼠體內。末次注射后48小時,建立急性酒精性肝損傷模型,取小鼠肝臟,通過F4/80熒光染色檢測巨噬細胞耗竭情況,通過HE或尼羅紅染色實驗觀察巨噬細胞耗竭對酒精灌胃造成的肝臟脂肪蓄積的影響。2.體外實驗部分使用酒精或者LPS/ATP對小鼠原代肝細胞、HepG2或HepG2-ADH1細胞進行刺激,觀察A438079或P2X7R SiRNA對肝細胞脂肪變性或炎癥反應的作用。1)通過膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細胞進行體外培養(yǎng),并分別使用酒精或者LPS/ATP對其進行刺激,通過免疫熒光染色實驗觀察小鼠原代肝細胞中SREBP1的表達情況,通過油紅O染色實驗觀察小鼠原代肝細胞中脂肪蓄積情況并通過蛋白印跡實驗觀察IL-1β及HMGB1的表達情況;2)酒精或者LPS/ATP對小鼠原代肝細胞進行刺激同時P2X7R的選擇性抑制劑A438079、TLR4抑制劑CLI-095及Caspase1抑制劑Ⅳ,使用蛋白印跡實驗觀察Caspase1、ASC、IL-1β以及HMGB1的表達情況;3)使用不同濃度的酒精對分別對HepG2以及HepG2-ADH1細胞進行刺激,使用免疫熒光染色方法觀察HMGB1的表達及位置,并提取HepG2-ADH1細胞的總蛋白、漿蛋白以及核蛋白,并濃縮上清,使用蛋白印跡實驗觀察HMGB1在各組分中的表達情況。4)使用酒精對HepG2細胞進行刺激,并同時給與A438079及Caspase1抑制劑IV,通過免疫熒光實驗觀察SREBP1的表達情況,并提取蛋白通過蛋白印跡實驗檢測不同處理下LKBI、AMPK以及P-LKB1和P-AMPK表達的變化。結果:1.體內實驗中,急慢性酒精性肝損傷模型中均出現小鼠肝臟脂肪蓄積和炎癥相關因子表達;急性酒精性肝損傷模型中,末次酒精灌胃4小時后小鼠肝臟脂肪蓄積最為明顯;慢性P2X7R選擇性抑制劑A438079和P2X7R SiRNA對P2X7R的抑制或沉默均可以減少小鼠血清中ALT、TG以及肝臟組織中TG的含量,下調SREBP1的表達,減少小鼠肝臟中的脂肪蓄積并下調炎癥相關蛋白NLRP3、ASC、HMGB1等表達水平;另外A438079給與后酒精造成的小鼠肝臟中巨噬細胞的募集以及HMGB1由細胞核向細胞漿的轉移得到抑制;P2X7R SiRNA減少P2X7R在小鼠肝臟中的表達,降低了SREBP1靶基因Fasn、Scd1、Acly并上調PPARα的靶基因Cpt2的表達;巨噬細胞的耗竭可以緩解酒精暴露導致的小鼠肝臟中的脂肪蓄積。2.體外實驗中,ETOH或LPS/ATP的刺激均可以造成肝細胞中脂肪沉積,升高小鼠原代肝細胞中SREBP1和IL-1β的表達水平;A438079、TLR4抑制劑CLI-095及Caspase1抑制劑IV可以減少P2X7R-NLRP3通路相關蛋白的表達水平,減少IL-1β的表達及釋放;酒精性濃度依賴性的造成HepG2及HepG2-ADH1中HMGB1由細胞核向細胞漿的轉移:另外酒精暴露導致的HepG2中LKB1-AMPK的抑制,在給與A438079和Caspase1抑制劑IV后得到恢復。結論:P2X7受體的抑制或沉默通過阻斷P2X7R-NLRP3信號軸減少肝臟脂肪積累和IL-1β以及其他炎性因子的釋放從而減少ASH過程中的脂肪變性和炎癥反應;肝細胞中存在依賴于P2X7R-NLRP3的IL-1β釋放途徑;尋找P2X7R-NLRP3炎性小體信號通路的安全有效的抑制劑是治療ASH一項新選擇。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.1
【圖文】：

圖２．邋ＮＬＲＰ３炎性體組裝的示意圖

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 洪寶建;蘇麗韞;朱月霞;梁麗娟;徐芳;朱苗英;;NLRP3炎性體在糖尿病腎病腎間質炎癥反應中的作用[J];中華全科醫(yī)學;2017年01期

2 董元寶;尹麗娟;王英華;李偉真;王小龍;;NLRP3與急性心肌梗死患者預后的研究[J];中國實用醫(yī)藥;2017年04期

3 許莉;段逸群;陳宏翔;曾志良;王輝;;雌激素對白念珠菌誘導的小鼠腹腔巨噬細胞NLRP3表達的影響[J];中國麻風皮膚病雜志;2014年05期

4 郭志浩;王莉娜;馬根山;;NLRP3與心血管疾病關聯的研究進展[J];東南大學學報(醫(yī)學版);2014年01期

5 王茉琳;李曉光;王建杰;邱洪斌;關寶生;白雪;張淑紅;孫佳斌;;NLRP3炎性體在原發(fā)性高尿酸血癥患者中的表達[J];中國老年學雜志;2017年02期

6 陳f ;童娟;姚紅;;NLRP3與急性痛風性關節(jié)炎相關作用研究進展[J];華南國防醫(yī)學雜志;2014年12期

7 王振磊;孫萍萍;李天曉;黎曙霞;;白頭翁湯激活NLRP3炎癥小體治療炎癥性腸病的研究[J];中藥材;2012年08期

8 張龍玉;孫穎;黃昂;郝書理;李保森;張紀元;鄒正升;;酒精性肝病患者肝組織NLRP3炎癥復合體基因水平檢測及其意義[J];實用肝臟病雜志;2016年06期

9 宋先東;李揚;劉波;閆昭威;朱敏;;NLRP3炎性體與類風濕關節(jié)炎的相關性研究[J];中國現代醫(yī)生;2017年11期

10 徐超;張華;陳建麗;李國燕;祖育娜;李振華;;NLRP3對呼吸道合胞病毒誘導的肺臟炎癥的影響[J];中國地方病防治雜志;2016年12期

相關會議論文 前10條

1 毛志娟;韓海燕;季蘇瓊;楊清梅;葉鴻翔;薛崢;;NLRP3在帕金森病發(fā)病機制中的作用[A];中華醫(yī)學峰會暨中華醫(yī)學會神經病學分會第八屆全國中青年神經病學學術會議論文匯編[C];2015年

2 毛志娟;韓海燕;季蘇瓊;楊清梅;葉鴻翔;薛崢;;NLRP3在帕金森病發(fā)病機制中的作用[A];中華醫(yī)學會第十八次全國神經病學學術會議論文匯編（下）[C];2015年

3 王振磊;孫萍萍;李天曉;黎曙霞;;白頭翁湯激活NLRP3炎癥小體治療炎癥性腸病的研究[A];2013年廣東省藥師周大會論文集[C];2013年

4 譚夢珊;郁金泰;譚蘭;;NLRP3炎癥小體與阿爾茨海默病關系的研究進展[A];山東省2013年神經內科學學術會議暨中國神經免疫大會2013論文匯編[C];2013年

5 李灑麗;姚文旭;徐磊;武慧芳;劉宇;葉純;邱銀生;;黃芩苷對脂多糖誘導后仔豬外周血單核細胞NLRP3信號通路的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)藥理毒理學分會第十一屆會員代表大會暨第十三次學術討論會與中國毒理學會獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會第五次學術研討會論文集[C];2015年

6 鐘琳曄;楊汀;;NLRP3炎癥小體及其激活產物在慢性阻塞性肺疾病中的作用研究進展[A];中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2013第十四次全國呼吸病學學術會議論文匯編[C];2013年

7 張鈺;韓琛;王恒孝;;NLRP3炎性小體與酒精性脂肪性肝炎研究進展[A];第十四次中國中西醫(yī)結合實驗醫(yī)學學術研討會論文匯編[C];2017年

8 胡金蓮;馬秀娟;杜秀明;宗英;張子騰;陳基快;陸國才;;NLRP3炎癥小體對心肌細胞體外增殖能力的影響[A];2016年第六屆全國藥物毒理學年會論文集[C];2016年

9 冉文卓;周勇;劉田;劉永平;梅文秀;李萍;管茶香;;血管活性腸肽下調雙刺激下巨噬細胞NLRP3炎癥小體的啟動和活化[A];中國生理學會第24屆全國會員代表大會暨生理學學術大會論文匯編[C];2014年

10 張杰;周力;劉苓;;免疫組化檢測NLRP3炎癥復合體在診斷腸結核、炎癥性腸疾病中的價值探討[A];第十七屆西南地區(qū)消化病學術會議暨2014貴州省消化病及消化內鏡學術年會論文匯編[C];2014年

相關博士學位論文 前10條

1 李夏;P2X7受體基于NLRP3炎性小體調控酒精性脂肪性肝炎的機制研究[D];延邊大學;2019年

2 張子騰;NLRP3炎癥小體在小鼠疲勞樣行為中的作用及機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學;2018年

3 王麗娜;糞腸球菌及其LTA對NLRP3炎性體的活化作用及藥物干預研究[D];大連醫(yī)科大學;2016年

4 陰海鵬;多酚類化合物通過抑制NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用的研究[D];山東大學;2018年

5 邊曄;吸煙對大鼠NLRP3炎癥小體信號通路的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

6 盧亞奇;NLRP3炎癥小體活化在日本血吸蟲感染引起的肝纖維化中的作用及機制研究[D];華中科技大學;2018年

7 聞毅;NLRP3炎性小體活化在急性與慢性腎損傷中作用及機制的研究[D];東南大學;2018年

8 陳羽;NLRP3炎癥小體在非酒精性脂肪性肝炎的相關機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

9 蘇文君;NLRP3炎性小體在抑郁癥與糖尿病共病中的作用及其機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學;2019年

10 郎悅;NLRP3炎性小體在實驗性自身免疫性腦脊髓炎/實驗性自身免疫性神經炎發(fā)病中的作用及相關機制探究[D];吉林大學;2019年

相關碩士學位論文 前10條

1 丁小林;HBV C區(qū)基因對NLRP3炎癥小體信號通路調控機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

2 黃麗;NLRP3炎性體在小鼠炎癥相關肺癌發(fā)生中的作用[D];鄭州大學;2019年

3 王曼;PGE2/EP2R信號通路上調NLRP3炎性小體活性促進DR發(fā)生發(fā)展的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2019年

4 何平林;NLRP3炎癥小體對大鼠膀胱衰老的影響及其機制研究[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

5 李俊玫;布魯氏菌BtpB缺失株構建及其對山羊肺泡巨噬細胞NLRP3炎性體的影響[D];西北農林科技大學;2019年

6 鄧秀金;NLRP3炎癥小體和脂聯素在非酒精性脂肪性肝病中的研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

7 張許梅;AT1受體自身抗體通過NLRP3炎性小體-IL-1β通路誘導胰島β細胞功能受損[D];山西醫(yī)科大學;2019年

8 徐孟達;乙酸抑制NLRP3炎性體在炎性疾病中的保護作用及其機制[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學;2019年

9 顏亮;黃芩苷抑制巨噬細胞中NLRP3炎癥小體活化及其作用機制研究[D];暨南大學;2018年

10 王文倩;基于NLRP3炎癥小體的桂枝拮抗麻黃中樞多巴胺神經元毒性研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2018年

本文編號：2732584