【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段,是影響慢性肝病的重要環(huán)節(jié),因此肝纖維化的預(yù)防、治療乃至逆轉(zhuǎn)是阻斷肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化也成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究慢性肝病的焦點(diǎn)。我國(guó)是肝病高發(fā)國(guó)家,以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最為常見(jiàn),在目前尚無(wú)良好的抗病毒藥物的情況下,阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程成為治療慢性肝病的重要對(duì)策。 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝纖維化形成過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞成分,是肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的主要細(xì)胞來(lái)源,因此抑制HSCs活化與增殖則成為阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的主要途徑之一。 細(xì)胞遷移是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育以及組織損傷、修復(fù)和炎癥反應(yīng)必不可缺的病理生理過(guò)程,在肝組織修復(fù)及肝纖維化形成過(guò)程中,損傷局部大量HSCs聚集可能與HSCs定向遷移有關(guān)。細(xì)胞遷移涉及到細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附相關(guān)的動(dòng)態(tài)組裝和空間位置的變化。從細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)研究結(jié)果來(lái)看,細(xì)胞黏附、鋪展和遷移是一復(fù)雜且尚未完全闡明的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的病理生理過(guò)程。 近年來(lái),Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種器官組織慢性炎性纖維化中的作用受到了日益廣泛的關(guān)注。有研究表明,選擇性阻斷該信號(hào)通路可以改善纖維化器官的進(jìn)展和預(yù)后,但其在肝纖維化進(jìn)程中的作用機(jī)制目前尚不清楚。目前,該信號(hào)通路選擇性抑制劑國(guó)內(nèi)外均能生產(chǎn),如該研究達(dá)到預(yù)期效果,將為肝纖維化的治療提供一種新的選擇。 為此,我們從HSCs遷移著手,以ROCK-I、磷酸化肌球蛋白結(jié)合亞單位(myosin binding subunit , MBS Thr-697)、α-SMA為切入點(diǎn),有機(jī)結(jié)合整體和離體實(shí)驗(yàn),研究了Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成和大鼠HSCs遷移過(guò)程中的作用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下3部分:第一部分:大鼠肝纖維化組織ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA的動(dòng)態(tài)表達(dá) 目的:探討ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA蛋白及其mRNA在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化。 方法:采用膽總管結(jié)扎(bile duct ligation, BDL)方法制備大鼠肝纖維化模型,將80只雄性Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組和模型組。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動(dòng)物,假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE及Masson三色染色確定模型建立情況;免疫組織化學(xué)、Western blot與RT-PCR方法研究ROCK-I、α-SMA蛋白及其mRNA在肝纖維化不同時(shí)期肝組織中的分布及含量的動(dòng)態(tài)變化;采用Western blot方法檢測(cè)ROCK-I底物—肌球蛋白磷酸酶結(jié)合亞單位第697位蘇氨酸(MBSThr-697)的磷酸化水平,作為Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo);采用特異性熒光染色方法檢測(cè)肝纖維化不同時(shí)期肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化。 結(jié)果:①隨著肝纖維化的發(fā)展,大鼠肝臟中ROCK-I、α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,主要分布在匯管區(qū)、纖維間隔及增生的膽管周?chē)?xì)胞,造模1~4wk大鼠肝組織ROCK-I (14.71%±4.01%、20.66%±2.34%、26.21%±1.74%、32.50%±2.55%)、α-SMA (13.62%±1.48%、23.25%±2.02 %、27.92%±1.61%、33.69%±1.99%)的陽(yáng)性面積顯著性高于正常組(5.35%±1.30%、6.22%±1.56%),P0.05。②Western blot結(jié)果顯示,正常大鼠ROCK-I蛋白表達(dá)水平較低,在肝纖維化發(fā)生早期即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),至病變后期仍維持較高水平,模型組1~4wk其表達(dá)分別較正常對(duì)照組增加0.83倍、1.14倍、1.96倍、2.33倍,假手術(shù)組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,P0.05;磷酸化MBS Thr-697蛋白模型組1~4wk分別較正常對(duì)照組增加0.80倍、1.37倍、2.29倍和3.34倍,假手術(shù)組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,P0.05;α-SMA蛋白模型組1~4wk分別較正常對(duì)照組增加0.48倍、0.87倍、1.49倍和2.10倍,假手術(shù)組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,P0.05。③RT-PCR結(jié)果顯示,正常大鼠肝組織中有α-SMA基因表達(dá),模型組第2天(264.69±30.28)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),至第21天(817.33±67.60)達(dá)高峰后有所下降,至模型后期(801.67±78.50)仍高于基礎(chǔ)表達(dá)(245.33±27.16)。ROCK-I電泳條帶的光密度掃描顯示,正常大鼠肝組織中就有ROCK-I基因表達(dá),在纖維化發(fā)生早期即出現(xiàn)明顯上調(diào),至第14天(722.67±86.08)達(dá)高峰而后下降,至病變后期(第28天)(707.00±82.79)仍高于基礎(chǔ)表達(dá)(276.33±37.45),并且與α-SMA表達(dá)呈顯著性正相關(guān)(r=0.718,P0.05)。④用FITC標(biāo)記的鬼筆毒環(huán)肽熒光染色,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,正常大鼠肝臟F-actin位于細(xì)胞周邊,可見(jiàn)少量肌動(dòng)蛋白絲,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),肝組織熒光信號(hào)增強(qiáng)。 結(jié)論:肝纖維化形成過(guò)程中,ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697和α-SMA表達(dá)明顯增加,提示ROCK-I在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中不但有表達(dá)上調(diào),而且有功能活化;ROCK-I mRNA表達(dá)水平較α-SMA提前達(dá)峰值,提示ROCK-I可能通過(guò)誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞表型形成而參與肝纖維化的發(fā)生;肝纖維化形成過(guò)程中,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),可見(jiàn)大鼠肝組織特異性熒光信號(hào)增強(qiáng),細(xì)胞間規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失,提示肝纖維化時(shí)肌動(dòng)蛋白大量增生,同時(shí)發(fā)生細(xì)胞骨架重組。 第二部分:ROCK-I抑制劑Y-27632抑制大鼠肝星狀細(xì)胞黏附與遷移 目的:觀察Rho/ROCK信號(hào)通路特異性阻斷劑Y-27632對(duì)大鼠HSCs ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA表達(dá)及HSCs黏附、遷移和細(xì)胞骨架的影響,探討該信號(hào)通路在HSCs黏附、遷移過(guò)程中的作用。 方法:應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),采用MTT法測(cè)定HSCs增殖;甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定HSCs黏附率;Boyden小室跨膜遷移分析法測(cè)定HSCs遷移;FITC標(biāo)記鬼筆毒環(huán)肽測(cè)定HSCs細(xì)胞骨架變化;Western blot測(cè)定ROCK-I底物—磷酸化MBS Thr-697蛋白表達(dá),作為Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo);采用RT-PCR方法研究ROCK-I、α-SMA mRNA在HSCs不同干預(yù)組的變化。 結(jié)果:①不同濃度Y-27632作用于HSCs 24h,10μmol/L Y-27632細(xì)胞黏附抑制率為2.56%,與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P0.05);20μmol/L、30μmol/L Y-27632組細(xì)胞黏附抑制率分別為31.21%,60.91%,與正常對(duì)照組相比,細(xì)胞黏附率明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②10、20、30μmol/L Y-27632作用于HSCs24h,其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為5.98%、25.36%、33.24%;20μmol/L Y-27632作用于HSCs12h、24h、48h后其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為17.58%、25.36%、46.93%,說(shuō)明Y-27632具有抑制HSCs增殖作用,在一定濃度范圍內(nèi),呈明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。③細(xì)胞跨膜遷移結(jié)果分析顯示:對(duì)照組12h、24h、48h跨膜細(xì)胞數(shù)分別為23.40±5.19、33.20±8.27和38.60±9.23;20μmol /L Y-27632作用于HSCs12h、24h、48h后,其跨膜細(xì)胞數(shù)分別為19.30±4.19、13.00±3.32和7.9±2.42,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。④Y-27632作用于HSCs 24h后,ROCK-I蛋白較對(duì)照組降低0.25倍,ROCK-I基因表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組降低52%,p-MBS Thr-697蛋白較對(duì)照組降低0.36倍,α-SMA蛋白較對(duì)照組降低0.47倍,α-SMA基因表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組降低0.47倍。⑤用FITC標(biāo)記的鬼筆毒環(huán)肽熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察,LPA誘導(dǎo)HSCs 20min后,出現(xiàn)粗而長(zhǎng)的應(yīng)力纖維,周邊肌動(dòng)蛋白絲帶模糊甚至消失,Y-27632作用于HSCs 20min后,周邊肌動(dòng)蛋白絲帶連續(xù)、光滑,應(yīng)力纖維消失。 結(jié)論:體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,ROCK-I特異性抑制劑Y-27632可以抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs增殖、黏附和遷移,在一定濃度范圍內(nèi),呈明顯的劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性;Y-27632可以抑制HSCs ROCK-I、α-SMA和p-MBS Thr-697的表達(dá);特異性熒光檢測(cè)F-actin研究表明,ROCK-I特異性抑制劑Y-27632可部分預(yù)防和逆轉(zhuǎn)LPA誘導(dǎo)的HSCs骨架重組。 第三部分:法舒地爾對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化組織及肝星狀細(xì)胞遷移的抑制作用 目的:觀察ROCK-I選擇性阻斷劑法舒地爾對(duì)大鼠肝纖維化組織ROCK-I、α-SMA、磷酸化MBS Thr-697表達(dá)及HSCs黏附、遷移和細(xì)胞骨架的影響。 方法:從動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定肝組織ROCK-I、α-SMA表達(dá);Western blot方法測(cè)定肝組織和HSCs ROCK-I、α-SMA、磷酸化MBS-Thr697表達(dá);RT-PCR方法測(cè)定肝組織和HSCs ROCK-I、α-SMA mRNA表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定HSCs ROCK-I、α-SMA表達(dá);特異性熒光染色檢測(cè)細(xì)胞骨架變化。 結(jié)果:①BDL+法舒地爾注射組造模1~4wk大鼠肝組織ROCK-I (6.49%±3.78%、9.32%±2.05%、10.37%±2.56%、12.41%±3.79%),α-SMA (7.16%±1.89%、9.53%±2.18%、12.39%±3.46%、15.15%±4.68%)的陽(yáng)性面積均顯著低于BDL組和BDL+生理鹽水注射組(P0.05)。②Western blot結(jié)果顯示,BDL+法舒地爾注射組,造模第4wk ROCK-I蛋白較BDL組降低了38.68%,p-MBSThr-697蛋白較BDL組降低了30.69%,α-SMA蛋白較BDL組降低了20.50%。RT-PCR結(jié)果顯示,BDL+法舒地爾注射組造模第4wk ROCK-I mRNA較BDL組降低了32.39%,α-SMA mRNA較BDL組降低了34.46%。③法舒地爾作用于HSCs 12h、24h、48h,細(xì)胞黏附抑制率分別為19.25%、34.55%和68.22%,其跨膜細(xì)胞數(shù)分別為17.54±3.26、11.25±2.55和8.13±1.24,均明顯低于對(duì)照組,P0.05。④Western blot結(jié)果顯示,法舒地爾作用于HSCs 24h后,ROCK-I蛋白較對(duì)照組降低0.43倍,磷酸化MBSThr-697較對(duì)照組降低0.43倍,α-SMA蛋白較對(duì)照組降低0.48倍;RT-PCR結(jié)果顯示,法舒地爾作用于HSCs 24h后,ROCK-I mRNA較對(duì)照組降低0.55倍,α-SMA mRNA較對(duì)照組降低0.52倍。⑤FITC標(biāo)記的鬼筆毒環(huán)肽熒光染色結(jié)果顯示,BDL+法舒地爾注射組與BDL組相比,可見(jiàn)大鼠肝組織細(xì)胞間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稍規(guī)則,周邊肌動(dòng)蛋白絲帶連續(xù),熒光信號(hào)減弱。LPA誘導(dǎo)HSCs 20min后,再加入25μmol /L法舒地爾孵育30min,HSCs周邊肌動(dòng)蛋白絲帶變細(xì),應(yīng)力纖維明顯減少。 結(jié)論:ROCK-I選擇性阻斷劑法舒地爾可抑制BDL大鼠模型肝組織ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達(dá);體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,阻斷劑法舒地爾可抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs黏附和遷移,在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的時(shí)間依賴(lài)性,同時(shí)法舒地爾可抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs表達(dá)ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA;特異性熒光檢測(cè)F-actin研究表明,法舒地爾可部分抑制BDL大鼠肝組織F-actin重構(gòu),同時(shí)可部分預(yù)防和逆轉(zhuǎn)LPA誘導(dǎo)的HSCs骨架重組。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【引證文獻(xiàn)】

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1 杜宏波;扶正化瘀大鼠含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞mRNA及miRM表達(dá)譜調(diào)控研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2731372