【摘要】：第一部分IL-10基因轉化大腸桿菌的研究 目的：利用小鼠白介素-10基因轉化大腸桿菌,使所轉化的細菌表達并分泌IL-10。 方法：根據(jù)mIL-10的基因序列及大腸桿菌載體的多克隆位點,經過優(yōu)化修飾mIL-10基因序列,合成新mIL-10編碼基因序列,連接至原核表達載體pET32a+并測序,EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定目的基因片段的大小。用基因工程技術將含有mIL-10基因序列的pET32a+/mIL-10克隆到原核表達載體Origami B(DE3),在體外經IPTG誘導表達,選擇最佳的誘導條件。Western blot對目的蛋白進行鑒定,并探討IL-10對LPS所誘導RAW264.7激活的抑制作用。 結果：優(yōu)化的mIL-10基因序列在氨基酸翻譯上同源性為100%,重組的原核表達載體OrigamiB (DE3)/pET32a+mIL-10在體外可以高效表達,最佳的誘導時間為IPTG 1mmol誘導3小時表達量最大,細菌培養(yǎng)基中可檢測目的蛋白的表達,濃度為3.96ng/ml。Western blot檢測目的蛋白具有良好的抗原反應性,IL-10能夠有效抑制LPS對RAW264.7的激活作用,減少TNF的釋放。 結論：mIL-10轉化大腸桿菌能表達具有生物學效應的IL-10。 第二部分IL-10基因轉化的大腸桿菌對小鼠結腸炎的治療研究 目的：研究經IL-10基因轉化的大腸桿菌對DSS小鼠結腸炎腸道炎癥的影響,并探討其相關機制。 方法：將IL-10基因轉化的大腸桿菌簡稱為E.coli-IL-10,空質粒轉化菌則簡稱為E.coli0;將小鼠隨機分成6組：正常組對照組,DSS組,DSS+E.coli/IL-10組,DSS+E.coli0組,正常鼠+E.coli/IL-10組以及正常鼠+E.coli組。建立小鼠急性DSS結腸炎模型。自小鼠模型建立第1天開始,DSS+E.coli/IL-10組和正常鼠+E.coli/IL-10分別給予重組IL-10大腸桿菌1×108cfu/天灌胃至實驗結束,DSS+E.coli和正常鼠+E.coli分別給予空質粒大腸桿菌灌胃至實驗結束,正常對照組以及DSS組給于同等培養(yǎng)基灌胃至實驗結束。每天觀察各組疾病活動指數(shù)(DAI),并在實驗結束后檢測各組小鼠炎癥腸段腫瘤壞死因子(TNF)和髓過氧化物酶(MPO)等的含量,并測定小鼠結腸核因子(NF)-KB P65表達。 結果： 1.DAI評分：DSS-E.coli/IL-10組小鼠的DAI評分與DSS組和DSS-E.coli0兩組相比得分明顯較低(P0.05), DSS-Ecoli0組與DSS組之間DAI得分無明顯差異(P0.05)；對照組與正常鼠+Ecoli0、正常鼠+Ecoli/IL-10間3組DAI得分均為0。 2.組織學評分：DSS-Ecoli/IL-10 (6.22±3.30)低于DSS組和DSS-Ecoli0[(10.54±4.15)和(10.0±3.00)](P0.05),后兩者直接得分無統(tǒng)計學差異(P0.05)；飲用DSS水各組均高于對照組(0.88±0.31)(P0.05)。 3.MPO活性：DSS+E.coli/IL-10組(2.35±0.39)明顯低于DSS組和DSS+Ecoli0組[(4.15±0.77)和(3.5±1.23)](P0.05),高于其他3組(P0.05)。 4.組織勻漿TNF含量：DSS組(237.85±47.01)與DSS-Ecoli0(239.81±50.38)組之間無明顯差異(P0.05),高于其他4組(P0.05)；DSS-Ecoli/IL-10組(172.46±66.71)低于DSS組以及DSS-Ecoli0(?)且(P0.05),高于對照組(P0.05)。 5.結腸粘膜NF-kB表達：DSS-Ecoli/IL-10組小鼠粘膜中NF-kB的活性明顯低于DSS組和DSS-Ecoli0組(P0.05),飲用DSS水的3組小鼠的粘膜NF-kB活性明顯比飲用自來水的3組小鼠活性高,DSS組與DSS-Ecoli0兩組間NF-kB活性無顯著差異(P0.05)。 結論：利用經IL-10基因轉化的大腸桿菌可以明顯緩解DSS小鼠的結腸炎癥損傷,減低MPO活性、抑制炎癥腸段炎癥細胞NF-kB的活化及炎性細胞因子的分泌。利用基因工程技術結合腸道共棲菌表達IL-10可以為IBD治療提供一個新的方法。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R574.62
【圖文】：

圖3.mlL一10全基因合成測序報告檢測報告顯示，所合成基因序列與預期設定的基因序列同源性100%，無堿基對錯一誤。1.2請北京三博遠志公司合成并連接于pET32a載體，測序結果如下(祥見附錄l):TGATATCGGATCCGAATTCATGCCAGGTAGCGCGCTGCTGTGCTGCCTGCTGCTGCTGACCGGCATGCGTATCTCCCGTGGCCAGTACAGCCGTGAGGATAACAACTGCACCCATTTCCCGGTTGGTCAGAGCCACATGCTGCTGGAACTGCGTACTGCGTTCAGTCAGGTTAAAACCTTCTTTCAGACCAAAGATCAGCTGGACAATATCTTACTCACCGATTCTCTGATGCAGGATTTCAAAGGCTACCTGGGTTGCCAGGCTCTGTCTGAGATGATCCAGTTCTATCTGGTGGAGGTTATGCCGCAGGCCGAGAAACACGGCCCAGAAATTAAAGAACATCTGAACTCACTCGGTGAGAAACTGAAAACTCTGCGTATGCGCCTGCGTCGTTGCCATCGTTTTCTGCCTTGTGAGAATAAATCTAAGGCGGTTGAACAGGTGAAATCAGATTTCAACAAACTGCAGGACCAAGGCGTTTACAAAGCTATGAACGAATTCGATATTTTCATCAACTGTATTGAAGCATACATGATGATCAAGATGAAATCTTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGT

IL一10經雙酶切產物;2):pET32ajmll一1組pET犯叭L一ro表達質粒酶切鑒定電泳質粒經酶切反應后，產物用3%瓊左右出現(xiàn)一條帶，與所插入的小鼠鑒定重組質粒構建成功。表達的誘導表達影響5.不同誘導時間對mIL一10表達影響3J組5ET32a/IL一10/OrigamiB(DE3)inducing

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 ;IL-10-Producing Type 1 Regulatory T Cells and Allergy[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

2 甘華田,歐陽欽,陳友琴,粱峰;核因子-κB p65反義寡核苷酸對潰瘍性結腸炎腸黏膜單個核細胞細胞因子表達的影響[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2003年02期

3 趙躍然,游力,高春義,馮進波,許曉群,田志剛;人IL-10 cDNA克隆、表達及其生物學活性[J];中國生物制品學雜志;2002年06期

本文編號：2730945