【摘要】： 背景: 肝纖維化是各種原因引起慢性肝損傷后可逆性的創(chuàng)傷愈合反應(yīng),其持續(xù)進(jìn)展的最終結(jié)局為肝硬化。因此,阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有重要的臨床意義。近年來(lái)一些研究表明,肝星狀細(xì)胞的NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)通過(guò)產(chǎn)生活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)介導(dǎo)了多種促肝纖維化因子在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),成為調(diào)控肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)纖維生成反應(yīng)的信號(hào)傳遞樞紐。因此,通過(guò)調(diào)控NOX的活性和表達(dá),可抑制ROS產(chǎn)生,干擾各種促肝纖維化因子在HSC內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),有望成為治療肝纖維化的新靶點(diǎn)。熊果酸是存在于自然界的天然三萜類(lèi)化合物,它是許多傳統(tǒng)中藥的主要成分。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸在體外能抑制HSC增殖和誘導(dǎo)其凋亡,體內(nèi)能抑制DMN誘導(dǎo)的肝纖維化。但熊果酸對(duì)肝星狀細(xì)胞NOX是否有影響及影響機(jī)制尚不清楚。 目的: 觀察瘦素刺激HSC后細(xì)胞內(nèi)ROS的來(lái)源,以及熊果酸對(duì)ROS產(chǎn)生的影響;觀察熊果酸對(duì)NOX的亞基Rac1、P22PhoxmRNA表達(dá)以及對(duì)NOX活性的影響,探討熊果酸影響肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的機(jī)制。 方法: 1、為觀察瘦素刺激HSC后細(xì)胞內(nèi)ROS的來(lái)源及熊果酸對(duì)ROS產(chǎn)生的影響,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)隨機(jī)分為13個(gè)組:瘦素組(100 ng/ml),熊果酸(50uM)干預(yù)組、NAC(10mM)干預(yù)組、DPI(20uM)干預(yù)組、AG490(50uM)干預(yù)組、魚(yú)藤酮(20uM)干預(yù)組、2-雙(3-吡啶)1-丙酮(250 uM)干預(yù)組、別嘌呤醇(100uM)干預(yù)組、吲哚美辛(100uM)干預(yù)組、熊果酸(50uM)自身對(duì)照組、Rosup(5ug/ml)陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組和空白照組。按實(shí)驗(yàn)步驟選擇不同的藥物作用HSC 1h、12h或24h后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度來(lái)觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。 2、為觀察熊果酸對(duì)肝星狀細(xì)胞NOX的亞基Rac1、P22PhoxmRNA表達(dá)以及對(duì)NOX活性的影響,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)隨機(jī)分為7組:瘦素組(100 ng/ml),熊果酸(50uM)干預(yù)組、NAC(10mM)干預(yù)組、DPI(20uM)干預(yù)組、AG490(50uM)干預(yù)組、熊果酸(50uM)自身對(duì)照組和正常對(duì)照組。在藥物作用HSC 6h、12h或24h后,提取總RNA,采用RT-PCR檢測(cè)NOX亞基Rac1、p22Phox mRNA的表達(dá);同樣在藥物作用HSC 6h、12h或24h后,加入250μmol/l的NADPH孵育,通過(guò)分光光度計(jì)觀察NADPH的消耗量來(lái)分析NOX的活性。 結(jié)果: 1、正常對(duì)照組的DCF熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組高(P0.01),但明顯低于Rosup陽(yáng)性對(duì)照組(P0.01);瘦素組較正常對(duì)照組的DCF熒光強(qiáng)度明顯增高(P0.01),與Rosup陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P0.05);DPI干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度較瘦素組及Rosup陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P0.01),與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05);魚(yú)藤酮干預(yù)組、2-雙(3-吡啶)1-丙酮干預(yù)組、別嘌呤醇干預(yù)組及吲哚美辛干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯增高(P0.01),與瘦素組及Rosup陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P0.05);AG490干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度較瘦素組及Rosup陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P0.01),但較DPI干預(yù)組及正常對(duì)照組高(P0.05,P0.01)。 2、熊果酸干預(yù)組及熊果酸自身對(duì)照組1h的DCF熒光強(qiáng)度較瘦素組及Rosup陽(yáng)性對(duì)照組明顯為低(P0.01),但較正常對(duì)照組高(P0.01);熊果酸干預(yù)組12h、24h的DCF熒光強(qiáng)度不但比瘦素組低(P0.01),而且12h的DCF熒光強(qiáng)度較1h低(P0.01),24h的DCF熒光強(qiáng)度又較12h低(P0.01),在24h與DPI干預(yù)組無(wú)明顯差別(P0.05);NAC干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度明顯低于瘦素組及Rosup陽(yáng)性對(duì)照組(P0.01),但NAC12h、24h的DCF熒光強(qiáng)度較1h明顯為高(P0.01)。 3、瘦素組6h、12h、24h的Rac1mRNA較正常對(duì)照組的表達(dá)明顯升高(P0.01),其中又以12h表達(dá)水平最高;熊果酸干預(yù)組及熊果酸自身對(duì)照組6h、12h、24h的Rac1mRNA表達(dá)較瘦素組明顯為低(P0.01),與正常對(duì)照組的表達(dá)無(wú)明顯差別(P0.05);NAC干預(yù)組、DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組6h、12h、24h的Rac1mRNA與瘦素組的表達(dá)無(wú)明顯差別(P0.05),而且NAC干預(yù)組、DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組12h的Rac1mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.01),DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組24h的Rac1mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組(P0.01,P0.05)。 4、瘦素組6h、12h、24h的p22Phox mRNA較正常對(duì)照組的表達(dá)明顯升高(P0.01);熊果酸干預(yù)組及熊果酸自身對(duì)照組6h、12h、24h的p22PhoxmRNA表達(dá)較瘦素組明顯為低(P0.01),與正常對(duì)照組的表達(dá)無(wú)明顯差別(P0.05);NAC干預(yù)組6h的p22PhoxmRNA較正常對(duì)照組的表達(dá)明顯高(P0.01),但24h的p22PhoxmRNA表達(dá)較瘦素組低(P0.01);DPI干預(yù)組6h和24h的p22PhoxmRNA表達(dá)較瘦素組低(P0.01,P0.05);AG490干預(yù)組6h、12h的p22PhoxmRNA較正常對(duì)照組的表達(dá)高(P0.01,P0.05)。 5、瘦素組6h、12h、24h的肝星狀細(xì)胞NOX活性均較正常對(duì)照組明顯增高(P0.01);DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組6h、12h、24h的NOX活性均明顯低于瘦素組(P0.01);熊果酸干預(yù)組6h、12h、24h的NOX活性較瘦素組明顯為低(P0.01),且與DPI干預(yù)組無(wú)明顯差別(P0.05);NAC干預(yù)組6h、12h、24h的NOX活性高于正常對(duì)照組(P0.01),與瘦素組相比無(wú)明顯差別(P0.05)。 結(jié)論: 1、瘦素能刺激HSC產(chǎn)生ROS,其機(jī)制可能是通過(guò)JAK信號(hào)通路激活NOX,及(或)通過(guò)誘導(dǎo)NOX的亞基表達(dá)使NOX活性增加而產(chǎn)生ROS。 2、熊果酸干預(yù)后能明顯抑制瘦素誘導(dǎo)的HSC內(nèi)ROS的產(chǎn)生,并能抑制NOX亞基Rac1和p22Phox的mRNA表達(dá)及NOX活性,推測(cè)熊果酸可能通過(guò)抑制NOX亞基表達(dá)進(jìn)而抑制NOX活性,使ROS產(chǎn)生減少。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【圖文】：

瘦素刺激HSC1小時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的DCF熒光強(qiáng)度

附圖 2 不同 ROS 生成系統(tǒng)的抑制劑干預(yù) 1 小時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的 DCF 熒光強(qiáng)度A（瘦素組），D（DPI 干預(yù)組），G（正常對(duì)照組），H（ROT 干預(yù)組），I（MET 干預(yù)組），J（ALL 干預(yù)組），K（IND 干預(yù)組），M（Rosup 陽(yáng)性對(duì)照組）。36

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2728702