【摘要】：目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是由自身免疫介導(dǎo)的慢性進(jìn)展性肝臟炎癥性疾病。有研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSC)在AIH的治療中已經(jīng)取得了一定的臨床效果,但具體機(jī)制尚有爭(zhēng)議。越來(lái)越多的研究證明巨噬細(xì)胞在參與MSC修復(fù)損傷肝臟具有重要作用,但巨噬細(xì)胞通過(guò)何種方法影響間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)損傷肝臟的機(jī)制尚不明確。人們普遍認(rèn)為炎癥與氧化應(yīng)激有關(guān),而Nrf2是機(jī)體防御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子,可促進(jìn)HO-1的轉(zhuǎn)錄,HO-1調(diào)節(jié)并參與機(jī)體的抗炎、抗凋亡及抗氧化應(yīng)激,在巨噬細(xì)胞中普遍表達(dá)�，F(xiàn)已有研究證明HO-1刺激M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化M2型巨噬細(xì)胞,本研究通過(guò)移植間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠自身免疫性肝炎,探討間充質(zhì)干細(xì)胞移植后肝臟內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化是否與HO-1有關(guān)。探討HO-1與巨噬細(xì)胞的極化及間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果是否具有相關(guān)性,為將來(lái)開(kāi)展間充質(zhì)干細(xì)胞治療自身免疫性肝炎提供理論依據(jù)。方法:第一部分:小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療自身免疫性肝炎小鼠1、建立急性AIH小鼠模型:雌性小鼠經(jīng)鼠尾注射ConA構(gòu)建急性自身免疫性肝炎模型。造模后檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及肝臟組織病理結(jié)果確定模型是否成功。2、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞療效評(píng)價(jià):在AIH小鼠成模后,將其分為AIH+MSCs組和AIH組,AIH模型小鼠經(jīng)鼠尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞,對(duì)照的AIH組小鼠經(jīng)鼠尾注射等體積的PBS,正常組注射等體積的PBS。比較三組小鼠的肝功能、肝臟病理、肝細(xì)胞凋亡及增殖情況,ELISA檢測(cè)小鼠上清中TNF-αIFN-γ、IL-6的表達(dá)情況,RT-PCR檢測(cè)肝臟組織中TNF-αIFN-γ、IL-6的表達(dá)情況,以評(píng)估間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性自身免疫性肝炎小鼠的療效。第二部分:小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療中巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的機(jī)制研究1、小鼠中肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的M1/M2的分布情況:用HO-1抑制劑Znpp和激動(dòng)劑Hemin將其分為AIH+MSCs+Znpp組和AIH+Hemin組。免疫熒光雙染檢測(cè)AIH組、AIH+MSCs組、AIH+MSCs+Znpp組和AIH+Hemin組小鼠肝臟組織中M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的分布情況。RT-PCR檢測(cè)INOS、Arg1在mRNA表達(dá)以反映肝臟組織中M1型巨噬細(xì)胞(INOS)和M2型巨噬細(xì)胞(Arg1)的分布情況。2、巨噬細(xì)胞極化的分子通路:在正常組、AIH組、AIH+MSCs組、AIH+MSCs+Znpp組和AIH+Hemin組,應(yīng)用Western、RT-PCR檢測(cè)各組肝臟組織中HO-1、Nrf2的表達(dá)情況。檢測(cè)各組臟組織的病理變化、肝臟組織的凋亡和增殖情況及小鼠上清中及肝臟組織中TNF-αIFN-γ、IL-6的表達(dá)情況。結(jié)果:第一部分:間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療自身免疫性肝炎小鼠的實(shí)驗(yàn)研究1、自身免疫性肝炎模型評(píng)價(jià):與正常組比較AIH組血清生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。肝臟病理示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟組織,大量的肝臟細(xì)胞壞死,肝內(nèi)血管擴(kuò)張,間充質(zhì)充血,肝竇組織紊亂,出現(xiàn)核固縮、核碎裂、核溶解,符合AIH模型標(biāo)準(zhǔn),建模成立。2、療效評(píng)價(jià):與AIH組相比,經(jīng)MSCs治療后的AIH小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶下降;肝臟病理觀察到肝臟細(xì)胞壞死、間充質(zhì)充血、肝竇組織紊亂、核固縮、核碎裂、核溶解情況得到改善;肝細(xì)胞凋亡得到明顯改善;肝細(xì)胞增殖明顯;TNF-αIFN-γ、IL-6的表達(dá)降低,以上指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分:巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的機(jī)制研究1、與AIH組相比,MSCs組小鼠以M2型巨噬細(xì)胞為主,而AIH組以M1型巨噬細(xì)胞為主,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、巨噬細(xì)胞極化的分子通路:與AIH組和AIH+MSCs+Znpp組相比較,在MSCs和Hemin移植治療的AIH小鼠,肝臟的壞死、核固縮、核碎裂、核溶解情況得到明顯改善;Nrf2和HO-1的表達(dá)增加。M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)升高,而M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)受到抑制;肝臟細(xì)胞凋亡情況得到明顯改善,肝細(xì)胞增殖明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);促炎因子TNF-αIFN-γ、IL-6表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠模型可模擬自身免疫性肝炎患者的病理、肝損傷及炎癥情況。小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞改善自身免疫性肝炎小鼠的肝功能及受損肝組織,減少肝細(xì)胞的凋亡,增加肝細(xì)胞的增殖,抑制促炎因子的表達(dá)。(2)MSCs通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路,促進(jìn)肝臟組織中M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化,維持自身免疫性肝炎小鼠模型肝臟炎癥內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,發(fā)揮其保護(hù)肝組織的作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.1
【圖文】：

自身免疫性肝炎小鼠模型：（A）正常組小鼠肝臟組織HE染色；（B）AIH小鼠肝臟組織HE染色

圖 2、自身免疫性肝炎小鼠模型：正常和 AIH 組小鼠血清中 ALT 和 AST 水平檢測(cè)，#P＜0.01.2.2 MSCs 移植對(duì)自身免疫性肝炎小鼠的影響為探究 MSCs 的移植是否對(duì)自身免疫性肝炎小鼠的肝臟有保護(hù)作用，我將培養(yǎng)好的 MSCs 以 1×106個(gè)鼠尾靜脈注射進(jìn) AIH 小鼠體內(nèi)。在 ConA 注射12 小時(shí)，與 AIH 組相比，在 MSCs 移植治療后的 AIH 小鼠的肝臟病理發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死區(qū)域減少，細(xì)胞核固縮、核碎裂、核溶解和肝細(xì)胞間質(zhì)出血情況得改善（圖 3）；肝臟功能水平顯著低于 AIH 組（圖 4），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05）。為了進(jìn)一步分析 MSCs 對(duì)肝臟的保護(hù)作用，用 TUNEL 免疫熒染色比較分析了 AIH 組小鼠和 MSCs 組移植治療后的 AIH 小鼠肝細(xì)胞凋亡況。結(jié)果表明 MSCs 移植治療的 AIH 小鼠 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即綠色熒光標(biāo)的肝細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（P＜0.05）（圖 5）。為明確 MSCs 對(duì)肝細(xì)胞再生影響，我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)比較 AIH 組和 AIH＋MSC 組小鼠 Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與 AIH 組相比，MSCs 的移植治療顯著上調(diào) AIH 小鼠 Ki的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）（圖 6）。這些結(jié)果表明 MSCs 能改善 AIH 小鼠肝損傷，減少肝臟細(xì)胞壞死和凋亡，增加肝細(xì)胞的增殖。

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