【摘要】： 促凋亡蛋白PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)作為重要的p53靶分子,屬于凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族,是BH3-only亞族的重要成員,僅擁有一個BH3結(jié)構(gòu)域,通過和其他家族成員的相互作用,發(fā)揮轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號的功能,在凋亡信號通路中處于中心位置。此外,它在進(jìn)化上極端保守,例如小鼠和人PUMA的基因同源性為91%,蛋白質(zhì)同源性為90%;puma基因通過可變剪接能夠產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄本,其中有活性的產(chǎn)物主要是PUMA-α(23kDa)和PUMA-β(18kDa)。 在生理狀態(tài)下PUMA受到嚴(yán)格地調(diào)控,基礎(chǔ)表達(dá)量較低;但在多種應(yīng)激因素(如DNA損傷,缺氧,糖皮質(zhì)激素及血清撤除等)刺激下,可通過p53依賴和非依賴兩條途徑被誘導(dǎo),產(chǎn)生顯著的促凋亡效應(yīng)。 由于肝再生過程中涉及到多個Bcl-2家族成員(如Bcl-2, Bcl-XL, Bax等)參與,但它們在肝再生早期的表達(dá)關(guān)系難以解釋此時細(xì)胞凋亡罕見的現(xiàn)象;此外BH3-only亞族分子對肝再生的調(diào)控作用未知,因此我們選擇了和已知的肝再生凋亡通路關(guān)系密切的PUMA作為研究的切入點,運(yùn)用腺病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)技術(shù),探討它對肝再生早期的影響及其作用機(jī)制。 本課題研究的主要內(nèi)容是:1、肝再生早期PUMA及其相關(guān)基因的表達(dá)變化;2、腺病毒介導(dǎo)基因過表達(dá)模型的建立;3、過表達(dá)PUMA對肝再生的影響。 首先,我們通過Western blotting、Real time PCR和免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn),PUMA在肝內(nèi)圍繞小葉中央靜脈呈極性分布,其基礎(chǔ)表達(dá)量較低;在肝再生早期(0h~72h)PUMA在mRNA和蛋白水平均發(fā)生顯著下調(diào),這種依賴轉(zhuǎn)錄的表達(dá)下調(diào)和轉(zhuǎn)錄抑制因子Slug的上調(diào)存在一定的相關(guān)性,而和p53在肝再生早期的上調(diào)無關(guān);與其密切相關(guān)的Bcl-2家族成員Bcl-XL和Bax在蛋白水平均逐漸上調(diào),并且Bax的變化與p53相關(guān),然而凋亡效應(yīng)酶Caspase 3卻未見激活。 為了解這些現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系,我們于是采用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù),通過尾靜脈注射的方法使重組腺病毒Ad-PUMA和腺病毒空載體Ad-GFP感染C57小鼠肝臟,令外源基因在肝臟過表達(dá),爾后進(jìn)行部分肝臟切除術(shù),檢測術(shù)后24h再生肝細(xì)胞的增殖和凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用高劑量(4×10~8 ifu)Ad-GFP感染小鼠,可以獲得約30%的肝臟感染效率,并能在注射后3~8天維持外源基因的表達(dá),對術(shù)后1~5天的再生肝重量無明顯影響;而用極高劑量(1×10~9 ifu)和高劑量(4×10~8 ifu)Ad-PUMA注射小鼠會誘導(dǎo)急性肝衰竭,注射后48h死亡率分別為100%和35.7%,組織學(xué)檢測顯示肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫、壞死,肝門部位嚴(yán)重出血和炎細(xì)胞侵潤。低劑量(2×108 ifu)Ad-PUMA預(yù)處理后,術(shù)前未見小鼠急性期死亡,肝臟也無異常表現(xiàn),但術(shù)后24h死亡率驟升至66.7%,解剖見殘余肝臟腫脹明顯,組織學(xué)檢測Ad-PUMA的肝臟感染效率僅約10%;Western blotting檢測術(shù)后24h PUMA較正常水平僅上調(diào)約1倍;PCNA和TUNEL染色表明再生肝細(xì)胞增殖減少,凋亡增多,并伴有明顯的炎癥改變;Ad-PUMA感染后能使Bcl-XL反應(yīng)延遲并上調(diào)Bax水平。與此對照,Ad-GFP在相同劑量下并不會引起小鼠急性期死亡和明顯的炎癥反應(yīng),也不顯著升高術(shù)后24h死亡率,同溶劑組(注射等體積PBS)比較亦無明顯差異。 因此我們認(rèn)為腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可以高效地使外源基因在肝臟表達(dá),并且腺病毒載體本身在當(dāng)前的劑量下不會產(chǎn)生顯著的肝臟毒性,經(jīng)Ad-GFP注射后小鼠的手術(shù)耐受性好,腺病毒載體并不影響再生肝的重量,不會干擾肝再生的總體進(jìn)程。 而PUMA的輕度過表達(dá)即可影響早期肝再生進(jìn)程,引起明顯的肝臟病理改變,說明它的下調(diào)對肝再生具有非常積極的意義,這可能是術(shù)后殘余肝細(xì)胞在再生早期抵御凋亡的機(jī)制之一。其生理意義在于:通過調(diào)節(jié)PUMA的表達(dá)水平來發(fā)揮肝細(xì)胞的自我保護(hù)作用,降低肝細(xì)胞對外界不良刺激的敏感性,提高對凋亡的反應(yīng)閾值,有利于肝細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。其作用機(jī)制可能包括在Slug調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)錄受抑,從而和Bcl-XL協(xié)同性調(diào)整表達(dá)水平,避免激活Bax以阻礙細(xì)胞凋亡;此外它的下調(diào)還可以解除對肝細(xì)胞增殖抑制,減少肝細(xì)胞壞死和降低炎癥反應(yīng)程度。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575
【圖文】：

軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文三、實驗結(jié)果（一）肝再生早期 PUMA 的表達(dá)情況1、PUMA 的 mRNA 水平變化首先在 mRNA 水平觀察了小鼠經(jīng)部分肝切術(shù)組（PH）和假手術(shù)組（SH）處ma 基因在肝再生早期（0h~72h）的變化情況，為此我們根據(jù) PUMA-α 和 PUM剪接特點，跨過它們共有的 3 號和 4 號外顯子設(shè)計引物，以檢測總 PUMA mR表達(dá)水平。通過 Real time PCR，我們發(fā)現(xiàn)在 PH 組，puma mRNA 自 PH 后急，至術(shù)后 24h 至最低點，約為 0h 的 1/5，此后也一直處于低水平；而在 SH 組后 6h 內(nèi)也同樣下調(diào)，但這種改變是一過性的，自 12h 起開始回升，此后便回礎(chǔ)水平（圖 1.1）。

腺病毒介導(dǎo)的 PUMA 過表達(dá)對小鼠肝再生2、PUMA 的蛋白水平變化進(jìn)一步地，我們采用 Western blotting 方法觀察 PUMA 蛋白在肝再生早期，以了解同 mRNA 水平的變化是否同步，從而探究 PUMA 在肝再生早期錄水平的調(diào)節(jié)。在 PH 組，PUMA 的 2 個轉(zhuǎn)錄本（PUMA-α 和 PUMA-β 6h 起逐漸下調(diào)，此后一直維持在較低水平；而在 SH 組 PUMA-α 的變化PUMA-β 在術(shù)后 12h 一過性下調(diào)后即恢復(fù)到基礎(chǔ)水平（圖 1.2）。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2723248