【摘要】： 整合素αvβ3受體顯像評估大鼠肝纖維化的可行性研究 肝纖維化(liver fibrosis)是不同病因引起的肝臟慢性損傷后實質(zhì)再生,同時伴隨間質(zhì)過度增生,潛在可逆的組織修復(fù)重建過程。肝纖維化評估對于慢性肝病的診斷和干預(yù)評價尤為重要,目前還沒一種可靠的肝纖維化無創(chuàng)性評估方法。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化和表型改變是肝纖維化發(fā)生的中心事件,決定著肝纖維化轉(zhuǎn)歸。血管新生(angiogenesis)是組織損傷修復(fù)的必要條件。HSC活化、細胞外基質(zhì)(extrocellural matrix,ECM)增多同時伴有新生血管形成是進展性肝纖維化修復(fù)重建中突出的病理特征。 整合素(integrin)是黏附分子家族中,由一個α亞基和一個β亞基非共價結(jié)合形成的跨細胞膜受體,介導(dǎo)細胞和ECM、細胞與細胞間的黏附和整合細胞內(nèi)外信息傳遞。生理情況下整合素為細胞非組成性表達,在整合素家族中各亞型的表達有時序性和分布特異性。整合素αvβ3亞型是最廣泛的ECM受體,主要介導(dǎo)間質(zhì)細胞與纖維連接蛋白、纖維蛋白原、Ⅰ型膠原、玻璃黏結(jié)蛋白、層黏蛋白、Ⅷ因子相關(guān)抗原(vWF)等ECM的黏附,并和血小板衍生的生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ-1)、內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)等細胞因子有信號協(xié)同作用,主要傳遞和細胞增殖、分化、運動、分布、定居、生存或凋亡等有關(guān)的細胞信號。正常肝組織僅門靜脈周圍表達少量整合素αvβ3,肝細胞、庫普弗細胞、靜止HSC和正常血管內(nèi)皮細胞不表達該亞型。實驗研究了整合素βvβ3在活化HSC和肝纖維化組織中的表達,探討整合素αvβ3表達、血管新生與肝纖維化間質(zhì)重塑的關(guān)系。 精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽模體是ECM中保守序列,也是ECM和整合素受體識別常見位點。整合素αvβ3能識別ECM中特異構(gòu)象的RGD配體。人工合成含RGD肽鏈高通量篩選發(fā)現(xiàn),精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)酪氨酸-賴氨酸(RGDyK)、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴氨酸(或RGDfK)等五肽分子也能和整合素αvβ3受體特異結(jié)合,對五肽中賴氨酸上活性氨基進行小分子修飾并不影響受體與配基結(jié)合活性。實驗中通過固相合成整合素αvβ3受體的RGD環(huán)肽(cRGD)配基,設(shè)計用羧基熒光素(FAM)和锝99同位素(~(99m)TC)等示蹤分子標記cRGD作為探針,探討人工合成的cRGD配基對活化HSC和肝纖維化組織的靶向性結(jié)合是課題研究的主要工作。 建立在肝纖維化組織間質(zhì)重建的分子病理基礎(chǔ)上,以~(99m)TC標記的cRGD為示蹤分子,通過單光子發(fā)射型計算機斷層成像(SPECT)探測肝纖維化不同時期肝臟放射性活度的相對變化(肝臟/心臟計數(shù)比值),并和常規(guī)B型超聲、磁共振儀(MRI)比較早期肝纖維化的影像表現(xiàn)。嘗試應(yīng)用分子影像方法,根據(jù)肝臟中整合素αvβ3受體結(jié)合cRGD配基的變化信息,來反映慢性損傷肝組織重建過程中活化細胞水平及與肝纖維化程度的關(guān)系,為建立一種敏感、特異、可靠的肝纖維化無創(chuàng)性受體顯像評估方法的可行性提供實驗依據(jù)。 課題研究分為以下六部分; 第一部分HSC的分離、培養(yǎng)、鑒定和體外活化模型的建立 [目的]建立一種穩(wěn)定可靠的HSC分離方法,為體外研究提供細胞模型。 [方法]Hank's液在體灌洗大鼠肝臟,離體后用Ⅳ膠原酶、鏈蛋白酶、DNaseⅠ消化肝臟,11%Nycodenz連續(xù)梯度液分離出大鼠HSC,計數(shù)細胞得率,0.2%臺盼藍染色計算細胞活率。自發(fā)熒光、透射電鏡、蘇丹Ⅲ染色觀察細胞脂滴,Desmin、α-SMA免疫化學(xué)和熒光染色對HSC進行鑒定和純度分析。分離后HSC按1-4×10~6密度接種于未包被塑料培養(yǎng)瓶或皿,含10%胎兒牛血清DMEM培養(yǎng)基,37℃含5%CO_295%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),通過延長培養(yǎng)誘導(dǎo)HSC活化。 [結(jié)果]分離HSC得率3.5±0.8×10~7/只大鼠,細胞活率＞90%,分離第1天自發(fā)熒光和第3天desmin染色陽性細胞＞90%。HSC隨著體外培養(yǎng)形態(tài)明顯改變,分離培養(yǎng)7天后α-SMA陽性細胞＞90%,培養(yǎng)14天或傳代后＞95%陽性。 [結(jié)論]肝臟離體后消化能達到在體消化同樣的效果,應(yīng)用Nycodenz密度分離介質(zhì)可獲得滿意HSC得率和純度。新分離大鼠HSC培養(yǎng)7天后超過90%激活表型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨疕SC。 第二部分整合素αvβ3受體在HSC活化過程中的表達 [目的]探討HSC表型轉(zhuǎn)變過程中整合素αvβ3受體和α-SMA的定性、定位、定量表達。 [方法]HSC培養(yǎng)的第1、3、5、7和14天分別提取細胞總RNA和總蛋白。總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,分別通過real-time PCR和Western Blot分析整合素αv、β3和α-SMA mRNA和蛋白質(zhì)在HSC活化過程中的表達。靜止期細胞和激活細胞期HSC,分別進行α-SMA和整合素αVβ3細胞免疫熒光染色激光共聚焦觀察。 [結(jié)果]HSC活化過程中整合素αVβ3表達水平變化有顯著性差異(P＜0.01),第14天時在mRNA和蛋白質(zhì)水平比第1天,分別增加18倍和5.2倍。而比較7天和14天時表達則無明顯差異。免疫熒光雙染色顯示活化HSC中整合素αVβ3極性表達于細胞膜,α-SMA表達于細胞漿并且和整合素αVβ3有共定位。 [結(jié)論]整合素αVβ3是激活狀態(tài)HSC的表型受體,表達上調(diào)與HSC活化和活化狀態(tài)維持有關(guān)。 第三部分整合素αvβ3 RGD環(huán)肽配基與HSC的結(jié)合分析 [目的]研究HSC對羧基熒光素(FAM)標記精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴氨酸(FAM-cRGD)環(huán)五肽的結(jié)合和內(nèi)化。計算活化HSC對~(125)Ⅰ標記精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)酪氨酸-賴氨酸的親和力和受體容量。 [方法]采用C末端保護固相法合成精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴氨酸環(huán)五肽,羧基熒光素合成樹脂上和環(huán)五肽中賴氨酸上的氨基固相結(jié)合為標記的熒光分子探針(FAM-cRGD)。高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜法(MS)檢測FAM-cRGD的純度和分子量。熒光示蹤觀察HSC對FAM-cRGD探針的攝取和內(nèi)化。流式細胞儀(FCM)分析HSC孵育FAM-cRGD后細胞平均熒光強度的變化和濃度、時間效應(yīng)。受體放射性配基結(jié)合分析(RBA)測定HSC對~(125)Ⅰ標記精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)酪氨酸-賴氨酸的平衡解離常數(shù)(Kd)和最大結(jié)合點數(shù)(Bmax)。 [結(jié)果]熒光示蹤顯示靜止HSC不結(jié)合FAM-cRGD探針,活化HSC結(jié)合FAM-cRGD并攝入細胞漿,但無細胞核的內(nèi)化。流式細胞儀分析提示,靜止期HSC和10μMFAM-cRGD 37℃孵育45分鐘,平均熒光強度和本底比較無明顯變化。而活化HSC和10μM FAM-cRGD 37℃孵育45分鐘,平均熒光強度較本底增高6.6倍,活化HSC和10μM FAM-cRGD、150μM cRGD 37℃共同孵育45分鐘,平均熒光強度抑制超過30%,活化HSC平均熒光強度改變有隨FAM-cRGD孵育濃度和孵育時間延長而增加的趨勢。受體放射性配基結(jié)合分析,通過Scatchard作圖法求出活化HSC對cRGD結(jié)合的Kd為4.808×10~(-9)mol/L和Bmax為2.112×10~(-10)mol/L。 [結(jié)論]活化HSC能與整合素αVβ3受體的cRGD發(fā)生受體-配基樣結(jié)合,活化HSC對cRGD配基有較高的親和力和受體容量。 第四部分肝纖維化中的整合素αvβ3表達與血管新生 [目的]建立兩種大鼠肝肝纖維化模型,探討肝纖維化組織中整合素αVβ3表達及與血管新生的關(guān)系。 [方法]硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射和膽總管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)建立兩種大鼠肝纖維化模型。建模的第3周末、9周末分別進行肝組織天狼星紅染色和計算機圖像分析、整合素αVβ3和血小板內(nèi)皮細胞黏附分子(CD31)免疫化學(xué)染色、整合素αVβ3和與α-SMA免疫熒光雙重染色及激光共聚焦觀察和real-time PCR和Western blot分析肝組織中整合素αVβ3、CD31在mRNA和蛋白表達水平表達的相對定量。 [結(jié)果]肝纖維化程度隨建模時間延長而加重。兩種肝纖維化大鼠和對照大鼠比較,肝組織中整合素αVβ3和CD31在mRNA和蛋白表達水平有顯著性差異(TAA組F=28.66,P＜0.01和F=19.62 P＜0.01,BDL組F=32.60 P＜0.01和F=42.36P＜0.01),隨肝纖維化進展而有升高的趨勢。免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色提示,在肝纖維化擴大的匯管區(qū)及纖維隔中有新生血管形成,在間質(zhì)中整合素αVβ3與α-SMA表達部位一致,從匯管區(qū)向肝實質(zhì)深入。 [結(jié)論]肝纖維化進展中整合素αVβ3表達水平增加與HSC活化和血管新生有關(guān),并與間質(zhì)重建程度平行。 第五部分肝組織整合素αVβ3放射自顯影和~(125)Ⅰ-cRGD在體內(nèi)的分布 [目的]分析肝纖維化組織對~(125)Ⅰ-cRGD配基的結(jié)合,和~(125)Ⅰ-cRGD在早期肝纖維大鼠中的分布。 [方法]硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射誘導(dǎo)大鼠肝纖維化,在第3周末、9周末分別進行肝組織冰凍切片,切片分別和~(125)Ⅰ-cRGD、~(125)Ⅰ-cRGD加500倍化學(xué)劑量cRGD(特異阻斷)進行4℃孵育2小時,沖洗切片后接觸法暴光2周,進行受體組織放射自顯影。6只正常大鼠和6只TAA3周肝纖維化大鼠,各3只分別進行尾靜脈注射6μCi ~(125)Ⅰ-cRGD,各3只注射500倍化學(xué)劑量cRGD特異阻斷后再注射6μCi ~(125)Ⅰ-cRGD、在注射后45min分別取材肝、脾、腦、腎、心、肺和肌肉,測定各臟器的放射性活度,計算各臟器放射性比活度(%ID/g)。 [結(jié)果]正常大鼠、TAA3周、TAA9周大鼠切片暴光后的相對灰度分別為8.1±1.6、18.7±2.6和28.7±3.4,用cRGD阻斷的切片相對灰度分別為7.7±1.7、12.1±2.5和19.3±3.3,三組間比較差異有顯著性(P＜0.01)。在TAA3周和TAA9周中,未用cRGD阻斷和cRGD阻斷比較差異有顯著性P=0.02和P=0.041,阻斷的切片中相對灰度降低。正常大鼠和TAA3周的早期肝纖維化大鼠中,~(125)Ⅰ-cRGD體內(nèi)分布以腎臟組織中最高,其次是肝臟,腦組織最低。正常大鼠中肝臟~(125)Ⅰ-cRGD的分布%ID/g,在未阻斷和阻斷大鼠分別為0.11±0.03、0.10±0.04,在TAA3周大鼠分別為0.17±0.02和0.12±0.03,4組比較F=5.175,P=0.049差異有顯著性,TAA3周大鼠肝臟中的%ID/g較高,在用cRGD阻斷時肝臟中放射性比活度有下降的趨勢。而比較各組間腎、脾、心、肺、腦、肌肉等臟器放射性比活度則差異無顯著性。 [結(jié)論]體內(nèi)外的研究提示肝纖維化組織對~(125)Ⅰ-cRGD配基有較高的結(jié)合和攝取,并能被未標記的cRGD所競爭。 第六部分肝臟整合素αvβ3受體顯像評估肝纖維化 [目的]以~(99m)Tc-DTPA-cRGD為示蹤劑應(yīng)用SPECT對肝纖維化大鼠肝臟中整合素αvβ3受體進行分子顯像,測定正常和肝纖維化大鼠間肝/心的放射性計數(shù)的比值。 [方法]硫代乙酰胺(TAA)腹腔誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。合成樹脂上二亞乙基三基三胺五乙酸(DTPA)固相結(jié)合cRGD(DTPA-cRGD),高锝酸鹽(~(99m)Tc04-)氯化亞錫還原法標記DTPA-cRGD(~(99m)Tc-DTPA-cRGD),紙層析法測定放射化學(xué)純度。TAA3周早期肝纖維化大鼠進行肝臟B型超聲和MRI掃描觀察影像表現(xiàn)。在TAA3周和TAA9周,尾靜脈注射~(99m)Tc-DTPA-cRGD 6mCi/只,用小動物SPECT進行大鼠腹部掃描,計算注藥后45min,感興趣區(qū)(ROI)的肝/心放射性計數(shù)比。 [結(jié)果]測定~(99m)Tc-DTPA-cRGD的放射化學(xué)純度＞95%,室溫下4小時保持穩(wěn)定。注射~(99m)Tc-DTPA-cRGD后45min,正常組、TAA3周和TAA9周組中感興趣區(qū)的肝/心放射性計數(shù)分別為1.73±0.35、2.7±0.44、3.73±0.65差異有顯著性(F=13.1,P=0.006)。比較正常大鼠和TAA3周大鼠,TAA3周和TAA9周大鼠組間感興趣區(qū)的肝/心放射性活度比值差異有顯著性(P＜0.05)。常規(guī)MRI和B型超聲檢測TAA3周的早期肝纖維化大鼠和正常大鼠在影像上無區(qū)別,SPECT掃描提示TAA3周大鼠肝臟對~(99m)Tc-DTPA-cRGD的積聚增加。 [結(jié)論]肝纖維化大鼠~(99m)Tc-DTPA-cRGD SPECT顯像肝/心放射性計數(shù)比值較正常大鼠明顯增加與肝組織中整合素αvβ3受體表達上調(diào)有關(guān)。SPECT和常規(guī)影像比較能提示早期肝纖維化中對~(99m)Tc-DTPA-cRGD攝取增強后的影像改變。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2
【圖文】：

結(jié)果1.大鼠新分離Hsc得率為3.5士0.8義107/肝臟，0.2%臺盼藍拒染細胞>90?0。2.相差顯微鏡下新鮮分離HSC形態(tài)呈現(xiàn)圓形、卵圓形(圖1一)，細胞內(nèi)含數(shù)量不一、大小不均折光性強的脂滴，暗視場中尤為明顯(圖1一B)。分離培養(yǎng)4小時后細胞貼壁率超過50%，培養(yǎng)24小時絕大多數(shù)HSC貼壁，細胞伸展，伸出偽足。72小時后部分細胞形態(tài)變化，伸展為梭形和不規(guī)則形，細胞內(nèi)脂滴減少(圖2一)，細胞培養(yǎng)7天后細胞增殖明顯，細胞體積增大為星型和不規(guī)則性，胞漿內(nèi)折光顆粒減少或消失。傳代的大鼠HSC生長速度明顯加快，細胞體積增大明顯為肌成纖維母樣細胞，傳代4一5細胞逐漸老化活力下降。(圖2一B)。

x100x100圖2A.培養(yǎng)3天HSC星形和不規(guī)則形B.培養(yǎng)7天HSC活化增殖明顯3.熒光顯微鏡下新分離HSC在328nm和445nm波長光激發(fā)下，細胞內(nèi)可分別自發(fā)強弱不均藍色和綠色熒光，并迅速變淡。培養(yǎng)7天細胞和陰性對照的MHCC97H細胞則無自發(fā)熒光。(圖3一A)4.蘇丹紅染色示細胞內(nèi)有圓形大小不等鮮紅色的脂滴染色。(圖3一B)5.透射電鏡觀察可見新分離細胞內(nèi)有圓形低密度的脂質(zhì)泡，部分細胞表現(xiàn)有脂質(zhì)的代謝障礙。(圖3()

【共引文獻】

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本文編號：2721453