【摘要】：目的： 建立體外腸缺血再灌注損傷模型,檢測谷氨酰胺對腸上皮細胞增殖活性及緊密連接蛋白occludin表達的影響,驗證谷氨酰胺對腸粘膜屏障的保護作用,并探討其作用機制。 方法： 選擇Caco-2細胞,利用缺氧(90min)/復(fù)氧(30min)的方法,在體外建立腸缺血再灌注損傷的模型,然后加入含有不同濃度谷氨酰胺的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。于造模后Oh、24h、48h,利用MTT比色試驗檢測細胞增殖活性,同時利用RT-PCR、 Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測occludin蛋白的表達情況。 結(jié)果： 1.利用Caco-2細胞,成功建立了體外腸缺血再灌注損傷模型。 2.造模完成后,立即檢測細胞增殖活性及occludin蛋白表達的變化。 ①MTT比色試驗檢測結(jié)果顯示,OD值明顯下降,Caco-2細胞增殖活性明顯降低(p0.01)。 ②RT-PCR結(jié)果顯示,Caco-2細胞occludin蛋白mRNA相對含量明顯降低(p0.05)。 ③Western blot結(jié)果顯示,Caco-2細胞occludin蛋白的表達未發(fā)生明顯變化(p0.05)。 ④免疫熒光結(jié)果顯示,熒光亮度及分布無明顯差異,在細胞間連接處都顯現(xiàn)出沿膜分布的明亮的蜂窩狀線性熒光。 3.造模后,加入含有不同濃度谷氨酰胺(Ommol/L,4mmol/L,8mmol/L,12mmol/L,16mmol/L)的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),并在24h和48h這兩個時間點,分別檢測OD值的變化。與未加谷氨酰胺組相比,谷氨酰胺濃度為4mmol/L和8mmol/L組細胞OD值明顯增大,細胞增殖活性明顯上升(p0.05)。而谷氨酰胺濃度為12mmol/L和16mmol/L的兩組,與谷氨酰胺濃度為8mmol/L組相比,OD值無明顯變化,細胞增殖活性變化不大(p0.05),故將這兩個濃度組排除。 4.造模后,向細胞培養(yǎng)液中加入含有不同濃度谷氨酰胺(Ommol/L,4mmol/L,8mmol/L)的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),并在24h和48h這兩個時間點進行實驗。 ①RT-PCR結(jié)果顯示,谷氨酰胺明顯促進Caco-2細胞occludin蛋白mRNA相對表達量的增加(p0.05),且具有一定的濃度相關(guān)性和時間相關(guān)性。 ②Western blot結(jié)果顯示,谷氨酰胺明顯促進Caco-2細胞促進occludin蛋白表達上調(diào)(p0.05),且具有一定的濃度相關(guān)性和時間相關(guān)性。 ③免疫熒光結(jié)果顯示,向細胞培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺能夠使Caco-2細胞occludin蛋白的熒光分布更加連續(xù)完整,熒光染色更強,且具有一定的濃度相關(guān)性和時間相關(guān)性。 結(jié)論： 1.利用Caco-2細胞,在體外建立腸缺血再灌注損傷模型后,細胞增殖活性明顯下降,occludin蛋白mRNA相對含量明顯降低,但該蛋白表達未見明顯變化。 2. Caco-2細胞缺血再灌注損傷后,谷氨酰胺能夠促進腸上皮細胞的增殖,同時在基因和蛋白水平上上調(diào)緊密連接蛋白occludin的表達。
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張宇飛;嵇武;黎介壽;;Occludin蛋白調(diào)控機制及臨床意義的研究進展[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2010年03期

本文編號：2715278