【摘要】：目的： 建立體外腸缺血再灌注損傷模型,檢測(cè)谷氨酰胺對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖活性及緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的影響,驗(yàn)證谷氨酰胺對(duì)腸粘膜屏障的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。 方法： 選擇Caco-2細(xì)胞,利用缺氧(90min)/復(fù)氧(30min)的方法,在體外建立腸缺血再灌注損傷的模型,然后加入含有不同濃度谷氨酰胺的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。于造模后Oh、24h、48h,利用MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,同時(shí)利用RT-PCR、 Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)occludin蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.利用Caco-2細(xì)胞,成功建立了體外腸缺血再灌注損傷模型。 2.造模完成后,立即檢測(cè)細(xì)胞增殖活性及occludin蛋白表達(dá)的變化。 ①M(fèi)TT比色試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,OD值明顯下降,Caco-2細(xì)胞增殖活性明顯降低(p0.01)。 ②RT-PCR結(jié)果顯示,Caco-2細(xì)胞occludin蛋白mRNA相對(duì)含量明顯降低(p0.05)。 ③Western blot結(jié)果顯示,Caco-2細(xì)胞occludin蛋白的表達(dá)未發(fā)生明顯變化(p0.05)。 ④免疫熒光結(jié)果顯示,熒光亮度及分布無(wú)明顯差異,在細(xì)胞間連接處都顯現(xiàn)出沿膜分布的明亮的蜂窩狀線性熒光。 3.造模后,加入含有不同濃度谷氨酰胺(Ommol/L,4mmol/L,8mmol/L,12mmol/L,16mmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),并在24h和48h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別檢測(cè)OD值的變化。與未加谷氨酰胺組相比,谷氨酰胺濃度為4mmol/L和8mmol/L組細(xì)胞OD值明顯增大,細(xì)胞增殖活性明顯上升(p0.05)。而谷氨酰胺濃度為12mmol/L和16mmol/L的兩組,與谷氨酰胺濃度為8mmol/L組相比,OD值無(wú)明顯變化,細(xì)胞增殖活性變化不大(p0.05),故將這兩個(gè)濃度組排除。 4.造模后,向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含有不同濃度谷氨酰胺(Ommol/L,4mmol/L,8mmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),并在24h和48h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 ①RT-PCR結(jié)果顯示,谷氨酰胺明顯促進(jìn)Caco-2細(xì)胞occludin蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的增加(p0.05),且具有一定的濃度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性。 ②Western blot結(jié)果顯示,谷氨酰胺明顯促進(jìn)Caco-2細(xì)胞促進(jìn)occludin蛋白表達(dá)上調(diào)(p0.05),且具有一定的濃度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性。 ③免疫熒光結(jié)果顯示,向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺能夠使Caco-2細(xì)胞occludin蛋白的熒光分布更加連續(xù)完整,熒光染色更強(qiáng),且具有一定的濃度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性。 結(jié)論： 1.利用Caco-2細(xì)胞,在體外建立腸缺血再灌注損傷模型后,細(xì)胞增殖活性明顯下降,occludin蛋白mRNA相對(duì)含量明顯降低,但該蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。 2. Caco-2細(xì)胞缺血再灌注損傷后,谷氨酰胺能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖,同時(shí)在基因和蛋白水平上上調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張宇飛;嵇武;黎介壽;;Occludin蛋白調(diào)控機(jī)制及臨床意義的研究進(jìn)展[J];腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng);2010年03期

本文編號(hào)：2715278