【摘要】：目的:炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性炎癥紊亂,發(fā)病機制不清。研究證實慢性炎癥中存在著粘膜缺氧,為了應對缺氧脅迫,生物有機體形成了一系列的調節(jié)機制。在多種調節(jié)途徑中,缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)是最主要的能夠應答細胞內氧氣濃度的降低而對多種基因進行調控的轉錄因子家族,與生物體的生長、發(fā)育及一些疾病的發(fā)病機理都存在著密切的關系。目前研究比較深入的包括HIF-1α和HIF-2α。研究證實IBD患者中發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α強烈激活。HIF-1α在IBD的發(fā)病機制中可能發(fā)揮雙重作用,既參加了損傷過程同時也表現(xiàn)了其保護作用。HIF-1α還對上皮間質轉化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)相關轉錄因子Twist、Snail、Slug具有調控作用。EMT對于IBD發(fā)病有重要作用,抑制EMT對于改善IBD臨床癥狀有潛在作用。HIF-2α通過TNF促進上皮炎癥反應。HIF-2α還可調控VEGF的表達,誘導新生血管形成。同時,腸道菌群在IBD發(fā)病中的作用日漸引人注目。布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii,Sb)是一種嗜熱的非致病性的酵母菌,數十年來應用于保護小腸損傷和炎癥。最近的臨床研究表明它在IBD中也許有作用,然而,作用機制不清。本研究主要探討Sb對小鼠實驗性結腸炎的療效及其對缺氧誘導因子的影響。方法:50只BALB/c小鼠隨機分為五組:(1)正常對照組:正常飲食,無特殊處理;(2)UC模型組:自由飲用3.5%DSS溶液7天造模;(3)Sb治療組:Sb溶液灌胃14天,后7天同時自由飲用3.5%DSS溶液;(4)生理鹽水(NS)對照組:NS灌胃14天,后7天同時自由飲用3.5%DSS溶液;(5)Sb對照組:Sb溶液灌胃14天。實驗期間每日觀察小鼠進食、飲水、活動等一般情況,稱量體重,觀察糞便性狀及糞便隱血、便血情況,計算DAI積分,評估結腸炎嚴重程度。采用HE染色檢測小鼠結腸組織損傷情況,并進行組織損傷評分。采用免疫組化法檢測緊密連接蛋白(occludin、claudin-1)、HIFs(HIF-1α和HIF-2α)及其相關蛋白(E-cadherin、vimentin)的表達與分布情況,并分別采用Real-time PCR和Western Blot方法檢測各組小鼠結腸組織中緊密連接蛋白(occludin、claudin-1)、ITF、HIFs(HIF-1α和HIF-2α)及其相關蛋白(E-cadherin、vimentin、VEGF、IL-6)的mRNA和蛋白表達水平。結果:1、Sb治療組小鼠實驗性結腸炎癥狀緩解明顯,DAI評分較模型組降低。2、光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Sb治療組大鼠組織損傷評分較模型組降低。3、Occludin:RT-PCR、免疫組化與WB顯示,與正常對照組相比,UC模型組和NS組occludin的mRNA以及蛋白表達明顯降低,Sb治療組減輕了DSS引起的occludin的mRNA以及蛋白表達的降低,Sb對照組與正常對照組無明顯差別。4、claudin-1:RT-PCR顯示:與正常對照組相比,UC模型組和NS組claudin-1mRNA無明顯改變,Sb治療組和Sb對照組claudin-1 mRNA明顯增加。免疫組化與WB顯示:與正常對照組相比,UC模型組和NS組claudin-1蛋白表達與分布明顯降低,Sb治療組減輕了DSS引起的claudin-1蛋白表達與分布的降低,Sb對照組與正常對照組無明顯差別。5、ITF:RT-PCR檢測顯示,UC模型組與NS組小鼠結腸組織中ITF mRNA的表達水平較正常對照組降低,Sb治療組和Sb對照組小鼠結腸組織中ITF mRNA的表達水平明顯升高。6、HIF-1α:RT-PCR檢測顯示,UC模型組與NS組小鼠結腸組織中HIF-1αmRNA的表達與正常對照組相似,Sb治療組和Sb對照組小鼠結腸組織中HIF-1αmRNA的表達水平明顯降低。免疫組化顯示:在正常對照組小鼠和Sb對照組小鼠的結腸組織中,免疫染色顯示HIF-1α彌散分布。在模型組小鼠和NS組小鼠中,核HIF-1α染色明顯增加,Sb治療組小鼠的結腸組織中核HIF-1α染色較UC模型組有所降低。WB結果顯示,正常對照組和Sb對照組小鼠結腸組織HIF-1α處于低水平表達;模型組小鼠和NS組小鼠結腸組織HIF-1α表達增加;Sb治療組小鼠結腸組織HIF-1α表達與UC模型組比較明顯降低。7、E-cadherin:RT-PCR、免疫組化與WB顯示:與正常對照組相比,UC模型組和NS組E-cadherin的mRNA以及蛋白表達明顯降低,Sb治療組減輕了DSS引起的E-cadherin的mRNA以及蛋白表達的降低,Sb對照組與正常對照組無明顯差別。8、vimentin:RT-PCR、免疫組化與WB顯示:與正常對照組相比,UC模型組和NS組vimentin的mRNA以及蛋白表達明顯增加,Sb治療組減輕了DSS引起的vimentin的mRNA以及蛋白表達的增加,Sb對照組vimentin的mRNA以及蛋白的表達與正常對照組無明顯差別。9、HIF-2α:RT-PCR檢測顯示,UC模型組與NS組小鼠結腸組織中的HIF-2αmRNA的表達較正常對照組明顯升高,Sb治療組小鼠結腸組織中HIF-2αmRNA的表達水平比模型組明顯降低。Sb對照組HIF-2αmRNA與正常對照組沒有明顯差別。免疫組化顯示,在正常對照組小鼠和Sb對照組小鼠的結腸組織中,免疫染色顯示HIF-2α彌散分布,在模型組小鼠和NS組小鼠中,核HIF-2α染色明顯增加,Sb治療組小鼠的結腸組織中核HIF-2α染色較UC模型組有所降低。WB結果顯示,正常對照組和Sb對照組小鼠結腸組織HIF-2α處于低水平表達;UC模型組小鼠和NS組小鼠結腸組織Sb表達明顯增加;Sb治療組與UC模型組比較明顯降低。10、VEGF:免疫組化與WB顯示,正常對照組小鼠結腸組織中VEGF表達量很低,UC模型組和NS組VEGF表達明顯增加,Sb治療組VEGF較UC模型組明顯下降。Sb對照組VEGF表達量與正常對照組沒有明顯差別。11、IL-6:WB顯示,正常對照組小鼠結腸組織中IL-6表達量很低,UC模型組IL-6表達明顯增加,Sb治療組IL-6表達量較UC模型組明顯下降。結論:1、實驗性結腸炎小鼠存在腹瀉、黏液血便、體重減輕等癥狀,DAI評分明顯增高,結腸黏膜存在炎癥性改變,組織損傷評分明顯增高,結腸黏膜緊密連接蛋白(occludin和claudin-1)和粘液層ITF表達減少。2、Sb可明顯改善實驗性結腸炎小鼠的腹瀉、黏液血便、體重減輕等癥狀和降低DAI評分,有效減少腸黏膜的炎癥,降低組織損傷評分,增加結腸黏膜緊密連接蛋白(occludin和claudin-1)和粘液層ITF表達水平。3、Sb可降低實驗性結腸炎小鼠結腸組織中的HIF-1α的蛋白的表達水平,繼而改善EMT,改善結腸炎。4、布拉氏酵母菌可降低實驗性結腸炎小鼠結腸組織中的HIF-2α的mRNA及蛋白的表達水平,繼而降低VEGF和IL-6等前炎癥因子的表達,改善結腸炎。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62
【圖文】：

各組小鼠體重變化情況3.2 DAI 評分參考 Hamamoto 等的方法對每只小鼠進行 DAI 評分，觀察指標包括體重下降大便性狀和糞便隱血情況。正常對照組和 Sb 對照組的 DAI 評分始終穩(wěn)定在零水平UC 模型組小鼠炎癥活動程度逐漸加重，NS 組與 UC 模型組的 DAI 評分趨勢一致示生理鹽水不能阻止病情的發(fā)展。Sb 治療組則有較好治療效果， DAI 評分明低于 UC 模型組。以服用 DSS 溶液后第 7 天 DAI 評分作比較分析，UC 模型組NS 組基本一致，Sb 治療組明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。（見表 4，圖表 4，各組小鼠 DAI 評分（X±SD）組別 DAI 評分正常對照組 0.0413±0.11667

各組小鼠 DAI 評分情況（* P<0.05 VS 正常組；# P<0.05 VS 模型組）3.3 組織損傷評分對每只小鼠的結腸病理切片進行組織學損傷學評分，參照 Dieleman，LA 等的評分標準[20]。圖 3 為各組小鼠服用 DSS 溶液后第 7 天的結腸組織損傷評分直方圖由圖可見，正常對照組和 Sb 對照組小鼠腸黏膜組織損傷評分很低，其余各組飲用3.5% DSS 7 天后的組織損傷評分均有不同程度升高。NS 組與 UC 模型組損傷的嚴重程度一致。Sb 治療組能明顯減輕結腸組織的損傷，表現(xiàn)為炎癥浸潤、病變深度隱窩破壞均不同程度減輕（P＜0.05）。（見表 5，圖 3）表 5，各組小鼠結腸組織學損傷評分表（X±SD）組別 組織損傷評分正常對照組 0.6667±1.32288

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本文編號：2714051