【摘要】：目的: ①探討HBV刺激不同TLR3表達水平的BeWo細胞后,各組BeWo細胞TLR3蛋白表達與HBV感染與復制的關系; ②探討HBV刺激不同TLR3表達水平的BeWo細胞后,各組BeWo細胞分泌TLR3信號轉導過程中相關細胞因子的水平與HBV感染與復制的關系。 方法: ①利用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000將抑制TLR3基因的質粒pEGFP-Genesil-tlr3轉染入BeWo細胞,以下調BeWo細胞的TLR3表達;用40ug/mlPolyI:C刺激BeWo細胞以上調TLR3蛋白的表達,然后用HBV感染各組細胞; ②本次實驗采用BeWo細胞與100ul HBV DNA含量為5.0×106(copies/ml)的病人血清共同培養(yǎng)作為HBV感染的方法,共設立四個組:正常對照組、HBV刺激正常細胞組、HBV刺激抑制TLR3質粒轉染組、PolyI:C+HBV刺激組,于HBV刺激各組細胞8h、16h、24h、48h后收集各組細胞的培養(yǎng)上清及細胞進行下一步實驗; ③用流式細胞術(FACS)測定以上各組細胞TLR3蛋白的表達量,并分析不同HBV刺激時間點下TLR3蛋白表達水平的變化;用熒光定量PCR法檢測HBV刺激后各組細胞培養(yǎng)上清中的HBV DNA載量; ④用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IL-10、TNF-α、IFN-β的表達。 結果: ①PolyI:C刺激BeWo細胞后,TLR3蛋白表達量增加,其平均熒光強度為65.11±2.73,正常對照組細胞為53.27±4.45,差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.536,P0.05)。 ②將抑制TLR3的質粒(pEGFP-Genesil-tlr3)用脂質體轉染法轉染入BeWo細胞后,其平均轉染效率為50.24%。 ③用FACS檢測不同時間點(8h、16h、24h、48h)HBV刺激各組BeWo細胞的TLR3蛋白表達量,其在四個實驗組中的4個不同時間點上差異均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。正常對照組BeWo細胞在4個時間點上TLR3蛋白平均熒光強度分別為52.88、53.78、55.07、54.70;HBV刺激BeWo細胞可使TLR3蛋白水平升高,在8h為62.50,16h為69.65,24h為71.78,48h為73.49,且隨時間變化TLR3蛋白表達水平有升高趨勢;PolyI:C +HBV刺激組TLR3蛋白表達量高于正常對照組及HBV刺激正常細胞組,8h為77.27,16h為85.36,24h為91.26,48h為88.27,在24h時TLR3蛋白表達量達到高峰;HBV刺激抑制TLR3質粒轉染組TLR3蛋白表達量先下降再升高,其在8h為46.19,16h為45.96,24h為46.34,48h為49.55,與正常對照組相比,除在48h差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)外,其他時間點均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 ④用熒光定量PCR法檢測HBV刺激正常細胞組、PolyI:C+HBV刺激組和HBV刺激抑制TLR3質粒轉染組的不同HBV刺激時間點(8h、16h、24h、48h)上各組細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA拷貝數(shù),結果顯示三組間差異在4個時間點上均有統(tǒng)計學意義(P0.05),且各組均隨著HBV刺激時間的延長,HBV DNA拷貝數(shù)降低。與HBV刺激正常組相比,PolyI:C+HBV刺激組HBV DNA拷貝數(shù)較低,HBV刺激抑制TLR3質粒轉染組的HBV DNA拷貝數(shù)較高。 ⑤在HBV刺激的4個時間點(8h、16h、24h、48h)上,PolyI:C+HBV刺激組分泌細胞因子IL-10、TNF-α、IFN-β的水平比HBV刺激正常細胞組高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);HBV刺激質粒轉染組分泌的細胞因子水平低于HBV刺激正常細胞組,不同時間點上差異也均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。隨著HBV刺激時間的延長,TNF-α表達水平在8h開始上升,24h達到高峰后開始下降;IL-10和IFN-β的表達水平在PolyI:C+HBV刺激組16h后上升幅度較大,其余各組上升較為緩慢。 結論 ①HBV刺激BeWo細胞后其TLR3蛋白表達增加;PolyI:C上調BeWo細胞TLR3蛋白表達水平后在HBV刺激下,TLR3蛋白表達量進一步升高;抑制TLR3質粒轉染的BeWo細胞在HBV刺激下TLR3蛋白表達量降低;同時HBV刺激后各組細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA拷貝數(shù)隨著TLR3蛋白表達量的升高而降低,從而說明TLR3在清除HBV感染與抑制HBV復制中起到重要作用。 ②HBV刺激能誘導BeWo細胞分泌細胞因子IL-10、TNF-α和IFN-β,PolyI:C刺激增強了BeWo細胞分泌細胞因子的能力,抑制TLR3質粒轉染的BeWo細胞在HBV刺激下其細胞因子分泌能力下降,說明TLR3是通過誘導BeWo細胞分泌其相關信號轉導途徑的細胞因子而發(fā)揮抗HBV感染的能力。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62
【圖文】：

圖 1-3 正常組 BeWo 細胞培養(yǎng) 48h（10×10） 圖 1-4 正常組 BeWo 細胞培養(yǎng) 96h（10×10）圖 1-5 HBV 刺激組培養(yǎng) 8h（10×10） 圖 1-6 HBV 刺激組培養(yǎng) 16h（10×10）

圖 1-3 正常組 BeWo 細胞培養(yǎng) 48h（10×10） 圖 1-4 正常組 BeWo 細胞培養(yǎng) 96h（10×10）圖 1-5 HBV 刺激組培養(yǎng) 8h（10×10） 圖 1-6 HBV 刺激組培養(yǎng) 16h（10×10）

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本文編號：2713341